Özet

Background: This study aims to investigate the role of different alleles of GC gene in the etiology of lung cancer.

Methods: The study included 77 patients with lung cancer (73 males, 4 females; mean age 59.6±9.2 years; range 21 to 72 years) and 25 healthy individuals (21 males, 4 females; mean age 47.3±5.4 years; range 23 to 61 years). Polymorphisms in vitamin D binding protein gene of all participants were examined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.

Results: Of the patients, the genotype 1S-2 was found in 32.4%, 1F-1S in 28.6%, 1S-1S in 28.6%, 1F-2 in 7.8% and 1F-1F in 2.6%, while the genotype frequencies in control group were 28%, 24%, 36%, 4% and 8%, respectively (p=0.35).

Conclusion: We did not detect any relationship between vitamin D binding protein gene polymorphisms and lung cancer.

Akciğer kanseri hem erkeklerde hem de kadınlarda sık görülen ve ölüme neden olan kanserler arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Ayrıca her iki cinsiyette de akciğer kanserine yakalanma riski yaş ile artmaktadır. Akciğer kanseri patolojisine göre küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) ve küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) olmak üzere ikiye ayrılmakla birlikte KHDAK tüm akciğer kanserlerinin %80’ini oluşturmaktadır.[1] Epidemiyolojik çalışmalar akciğer kanserine neden olan etmenler arasında tütün kullanımını ilk sırada göstermesine karşın akciğer kanserine yakalanan bireylerin %10’luk kısmının hiç sigara içmediği bildirilmiştir.[2,3] Bu da sigara kullanımının yanı sıra genetik ve epigenetik değişimler ile diğer çevresel faktörlerin de akciğer kanseri oluşumu ve gelişiminde etkisinin olduğunu göstermektedir.

Vitamin D bağlayan protein (VDBP) (GC veya Gc-globulin olarak da adlandırılmaktadır), 58 kDa ağırlığında karaciğer tarafından salgılanan bir proteindir. Plazma, serebrospinal sıvı ve B lenfositlerin membranında bulunur ve yüzey immünoglobülinleri ile etkileşerek işlev gösterir. Vitamin D bağlayan proteinin bilinen işlevlerinden bazıları makrofajları etkinleştirmesi (macrophage activating factor-MAF) ve nötrofilik reaksiyonlarda görev almasıdır. Vitamin D’nin metabolitlerine bağlanıp hedef dokulara taşımasının yanı sıra enflamatuvar reaksiyonun yoğunluğunu etkilemek gibi önemli bir işlevi daha bulunmaktadır.[4] Ayrıca monomerik G-aktin proteinine bağlanarak kan dolaşımına girmesini engeller. Böylece G-aktin proteininin filament oluşturmasını engelleyerek damar ve dokularda hasar oluşumunun önüne geçer.[5] Vitamin D bağlayan proteini kodlayan gen olan GC geni, insanda 4. kromozomun q11-q13 bölgesinde yerleşik olup 11. ekzonundaki tek nükleotid değişimine (SNP, rs4588 (420 ACG>AAG (Thr>Lys) ve rs7041 (416 GAT>GAG (Asp>Glu) bağlı olarak 1F, 1S ve 2 olmak üzere 3 izoformu yapılır.[6]

İleri evre kanser olgularında makrofajların yeterince etkinleşmemesinden ötürü, kanser gelişiminin hızlandığı düşünülmektedir. Vitamin D bağlayan proteinin görevlerinden biri olan makrofaj etkinleştirme özelliğinin kaybolmasının karsinogenezde önemli bir rolü olduğu düşünülmektedir.[7] Son yıllarda ayrıca VDBP’nin kardiyovasküler hastalıklar, otoimmün bozukluklar, diyabet, astım, Alzheimer ve tüberküloz gelişiminde ve çeşitli kanserlerde görevler aldığına dair kanıtların bulunduğu çalışmalar bulunmasına rağmen, eldeki veriler birbiriyle çelişir niteliktedir.[7-10]

Bu nedenle çalışmamızda GC geninin farklı alellerinin akciğer kanser etyolojisindeki yerini araştırmayı hedefledik.

Yöntem

İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalına başvurmuş ve akciğer kanseri tanısı konmuş olan 77 hasta (73 erkek, 4 kadın; ort. yaş 59.6±9.2 yıl; dağılım 21-72 yıl) ve 25 sağlıklı bireyden (21 erkek, 4 kadın; ort. yaş 47.3±5.4 yıl; dağılım 23-61 yıl) kan alınarak GC genotipleri belirlendi. Hasta ve sağlıklı bireylerden alınan kan örneklerinden standart yöntemlerle DNA izole edildikten sonra polimeraz zincir tepkimesi - kesim parçaları uzunluk polimorfizmi (polymerase chain reaction - restriction fragments length polymorphism; PCR-RFLP) yöntemi kullanılarak genotip saptaması yapıldı.

GC genotiplemesi için elde edilen DNA, PCR ile çoğaltılıp (Tablo 1) Hae III ve Sty I (Fermentas, Waltham, Massachusetts, USA) restriksiyon enzimleri ile 37 °C’de bir gece bekletilerek kesildikten sonra örnekler %3’lük agaroz jel elektroforezinde 120 V’ta 30 dakika boyunca yürütülerek UV ışık altında video jel görüntüleme sistemi (Vilber Lourmat, Cedex, Fransa) ile analiz edildi. GC genine özgü primer dizileri forward primer için 5’ TAA TGA GCA AAT GAA AGA AG 3’, revers primer için 5’ AAT CAC AGT AAA GAG GAG GT 3’ şeklindedir. Polimeraz zincir tepkimesi koşulları Tablo 1’de verilmiştir. Polimeraz zincir tepkimesi sonucu elde edilen ürün 388 baz çifti (bç) uzunluğunda olup Hae III enzimi ile kesildiğinde 295 bç ve 93 bç’lik bantlar elde edildiğinde alel tipinin 1S; StyI enzimi ile kesildiğinde ise 304 ve 84 bç’lik bantlar elde edildiğinde alel tipinin 2 olduğu belirlendi. Elde edilen ilk PCR ürünün iki enzimle de kesilmediği durumda alel tipinin 1F olduğu belirlendi. Genotip ve alel frekansları IBM-SPSS version 21.0 (IBM Corp. Released 2012. Armonk, NY, USA) programında Ki-kare testi ile analiz edildi ve p<0.05 anlamlı olarak değerlendirildi. Çalışma protokolü İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. Hastalar yapılacak işlem hakkında bilgilendirildi ve yazılı onamları alınmıştır. Çalışma Helsinki Deklarasyonu ilkeleri uyarınca gerçekleştirildi.

Tablo 1: Polimeraz zincir tepkimesi koşulları ve programı

Bulgular

Hae III ve StyI restriksiyon enzimleri ile yapılan kesimler sonucunda hastaların 1S, 1F ve 2 alelerinden hangisine sahip olduğu ve alellerin akciğer kanseri ile ilişkisi araştırıldı. Hastaların %6.5’ine (n=5) erken evre, %51.9’una (n=40) ise ileri evre KHDAK tanısı kondu (Tablo 2). Tüm hastalar sigara içiyordu. Çalışma sonucunda hastaların %32.4’ünün (n=25) 1S-2, %28.6’sının (n=22) 1F-1S, %28.6’sının (n=22) 1S-1S, %7.8’inin (n=6) 1F-2, %2.6’sının (n=2) ise 1F-1F genotipine sahip olduğu görüldü. Kontrol grubunda ise bireylerin %28’inin (n=7) 1S-2, %24’ünün (n=6) 1F-1S, %36’sının (n=9) 1S-1S,, %4’ünün (n=1) 1F-2 ve %8’inin (n=2) ise 1F-1F genotipine sahip olduğu görüldü. Hasta ya da kontrol grubunda 2-2 genotipine rastlanmadı. Hasta ve kontrol grupları genotip açısından karşılaştırıldığında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0.35) (Tablo 3). Hem hasta hem de kontrol grupları Hardy-Weinberg dengesine uygun olarak dağılmıştı (Hasta grubu için c2: 50.24, p=0.057 ve kontrol grubu için c2: 16.04, p=0.48). 1S, 1F ve 2 alellerinin akciğer kanserli hasta grubunda %59.1, %20.8 ve %20.1 sıklıkta bulunduğu görüldü. Sağlıklı kontrol grubunda da alel sıklıklarının hasta grubuna benzer olduğu ve sıklıklarının sırasıyla %62, %22 ve %16 olduğu saptandı. Her iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (p=0.811) (Tablo 4). Alellerin önemi koruyuculuk ya da risk açısından değerlendirildiğinde ise herhangi bir alelin akciğer kanserine karşı yatkınlık sağlayıcı veya koruyucu bir etkisi saptanmadı. Alellere ait göreceli olasılık oranı (Odds ratio) ve %95 güven aralığı değerleri Tablo 5’te verilmiştir. Herhangi bir alele sahip olmanın akciğer kanserine yatkınlık sağladığına veya koruyucu bir etkisinin olduğuna dair istatistiki anlamlılık elde edilemedi (p>0.05). Genotipler hasta yaşı, sigara kullanımı, evre ve patoloji ile karşılaştırıldığında anlamlı bir fark bulunmadı (sırasıyla, p=0.68, p=0.53, p=0.76 ve p=0.69).

Tablo 2: Hastaların ve kontrol grubunun klinikopatolojik verileri

Tablo 3: Hasta ve kontrol gruplarında genotip dağılımı

Tablo 4: Alel frekanslarının karşılaştırılması ve akciğer kanserine olan etkisi

Tablo 5: Göreceli olasılık oranı ve %95 güven aralığında genotip dağılım ve frekansları

Tartışma

Vitamin D sistemi aralarında hücre çoğalma ve farklılaşması başta olmak üzere birçok biyolojik yolağın düzenlenmesinde etkin olan sistemlerden biridir. Gerçek bir vitamin olmayan ancak calcitriol adlı hormonun öncüsü olan vitamin D, CYP24A1 (24-Hidroksilaz) ve CYP27B1 (1, a-Hidroksilaz) enzimlerinin aracılığı ile etkinleştiği zaman kendine özgü almaca (reseptöre) (Vitamin D Reseptörü-VDR) bağlanır ve oluşan bu kompleks hücre içerisine girip yazılım etmeni olarak işlev gösterir. Her ne kadar CYP24A1 etkinleşen vitamin D’nin yıkımını sağlayarak ortadan kalkmasına neden olsa da etkinleşmiş vitamin D’nin dolaşımdaki düzeyini belirleyen VDBP’dir. Glikozillenmiş-globulin olan VDBP, vitamin D’nin taşınması ve metabolitlerinin dolaşımında işlev görse de etkin toplayıcı (scavenger) sistemin bir üyesi olması nedeniyle doku ya da hücre hasarı sonrası oluşan zararlı etmenlerin ortadan kaldırılması ve F-aktin ağı oluşumunun engellenmesinde işlev gördüğünden karsinojenez açısından önem taşımaktadır. Vitamin D bağlayan protein aynı zamanda makrofaj etkinleştirilmesinde ve nötrofil kemotaksisinde rol oynadığından karsinojenezde büyük bir öneme sahiptir.[11] Bu nedenle, son yıllardaki birçok çalışmada plazma VDBP düzeyi ile kanser riski arasındaki ilişki yaygın şekilde araştırılmaya başlanmıştır.

Temel işlevi vitamin D’ye bağlanarak organizma içinde taşınmasını sağlamak olan VDBP, aynı zamanda çevresel etmenlere yanıt olarak yangısal (enflamatuvar) ve bağışıklık (immün) yanıtın düzenlenmesini de sağlar. Ancak vitamin D taşınmasındaki en önemli işlevlerinden biri vitamin D’nin akciğere taşınmasıdır. Bu nedenle VDBP akciğer hastalıkları ile ilgili olarak ayrı bir öneme sahiptir. Epidemiyolojik ve hayvan modelleri ile yapılan çalışmalar etkinleşmiş vitamin D metabolitlerinin serum 1,25(OH)2D akciğer kanseri gelişimini ve metastazını engellediğini göstermektedir.[12] Bunun dışında VDBP proteinin bronkoalveoler lavaj sıvısında bulunması nedeniyle kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), tüberküloz gibi hastalıklarda işlevi olabileceği düşünülmektedir.[13] Akciğer patogenezinde yer alan en önemli etmenlerden biri de tütün kullanımıdır. Sigara dumanında bulunan birçok toksik ve karsinojenik bileşen DNA, protein ve lipidler ile etkileşime girerek normal fizyolojik işlevin bozulmasına ve sağlık sorunlarına neden olmaktadır. Akciğer patogenezi ile ilişkili olduğu gösterilen VDBP de sigaranın bu olası zararlarından etkilenecek proteinlerden biridir. Vitamin D bağlayan protein kodlayan gen polimorfik bir gen olup, proteinin 416. ve 420. aminoasitlerindeki değişime neden olan polimorfizmlerin proteinin işlevi üzerinde etkili olduğu gösterilmiştir. Proteinin işlevinin kaybolmasına bağlı olarak makrofajlar yeteri kadar etkin olmayacağından, bağışıklık sistemi kanserli hücreleri yok etmede yetersiz kalabilir. Özellikle 420. konumdaki aminoasidin lizin kodlanmasına neden olan değişim sonucunda GC2 aleli oluşmaktadır. Yapılan çalışmalarda alel 2’nin makrofaj etkinleştirici özelliğinin daha az olduğu ve bunun sonucunda alel 2’yi taşıyan bireylerin makrofaj işlevinin daha düşük olduğu bildirilmiştir. Bugüne kadar yapılmış olan ve VDBP’yi kodlayan gendeki bu polimorfizmlerin (rs7041 ve rs4588) akciğer,[14] meme[15] ve prostat[16] kanseri ile ilişkili olduğunu öne süren çalışmalar olduğu gibi, GC polimorfizmlerinin prostat,[17] kolorektal kanser,[18,19] bazal hücreli karsinom[20] ve melanoma (sadece rs7041 incelenmiş)[21] ile ilişkisi olmadığını bildiren çalışmalar da bulunmaktadır. Literatürde bugüne kadar VDBP polimorfizmi ile akciğer kanseri arasındaki ilişkiyi araştıran çalışma sayısı çok kısıtlıdır. Maneechay ve ark.nın[14] yapmış olduğu çalışmada rs7041 (416 GAT>GAG (Asp>Glu) polimorfizminin akciğer kanseri ile ilişkili olduğu, 113 hastadan 61’inin TG genotipine sahip olduğu, bunun da akciğer kanseri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (p=0.037). rs7041 ve rs4588’deki tek nükleotid polimorfizmleri kombine olarak incelendiğinde ise 1F-2 (TT-CA) genotipine sahip olmanın akciğer kanserine karşı belirgin bir koruyucu etkisi olduğu görülmüştür (p=0.014). Ancak aynı çalışmada her iki genotipin de kolorektal veya meme kanseri ile ilişkisi bulunmamıştır.[14] Bizim çalışmamızda ise 1F-2 genotipine sahip birey sayısı hasta grubunun %7.8’lik, kontrol grubunun ise %4’lük kesimi oluşturmaktaydı. Bu açıdan bakıldığında bu genotiplerin akciğer kanseri ile herhangi bir ilişkisi bulunmadı. Aradaki farklılık çalışma gruplarının farklı ırklara ait olmasından kaynaklanıyor olabilir. Bu çalışmanın haricinde GC alellerinin akciğer kanseri ile ilişkisini gösteren bir çalışma bulunmadığı gibi, 1S ve 1F alellerinin çeşitli kanser türleri üzerindeki etkisi gösteren çalışma sayısı da kısıtlıdır.[22] Daha önce KOAH’lı hastalarda VDBP gen polimorfizmlerini incelemiş olduğumuz çalışmada, 1F ve 2 alelerinin KOAH’ın gelişimi veya engellenmesi ile ilişkisi olmadığını ancak 1S-1S genotipine sahip olmanın KOAH etyolojisi ile ilişkili olabileceğini gösterdik,[23] ancak bu çalışmamızda akciğer kanseri ve GC polimorfizmleri arasında herhangi bir ilişki saptayamadık. Beyazlarda yapılan bir çalışmada 1S, 1F ve 2 alel frekanslarının sırasıyla 0.56, 0.16 ve 0.28 olduğu gösterilmiştir.[24] Bizim çalışmamızda da elde etmiş olduğumuz sonuçlar bu verileri destekler niteliktedir. Ancak 1S, 1F ve 2 alelleri ile akciğer kanseri arasında anlamlı bir ilişki saptayamadık. Daha önce yapılmış olan ve özellikle Asyalılarda VDBP geni ile kanser arasında ilişki olduğunu gösteren çalışmalarda elde edilen sonuçlar büyük oranda etnik farklılıklar nedeniyle olabilir. Ayrıca çalışmamızdaki denek sayısının az olması yeterli istatistiki anlamlılığa erişilmesini de güçleştirmektedir.

Sonuç olarak, vitamin D bağlayan protein genotip dağılımının akciğer kanserli hastalar ile sağlıklı kontrol grubu arasında farklılık göstermediği, vitamin D bağlayan protein alel tiplerinden herhangi birinin akciğer kanseri için bir risk faktörü oluşturmadığı, aynı şekilde vitamin D bağlayan protein alel tiplerinden birinin akciğer kanserine karşı koruyuculuk da sağlamadığı gösterildi.

Çıkar çakışması beyanı
Yazarlar bu yazının hazırlanması ve yayınlanması aşamasında herhangi bir çıkar çakışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Finansman
Yazarlar bu yazının araştırma ve yazarlık sürecinde herhangi bir finansal destek almadıklarını beyan etmişlerdir.

Kaynaklar

1) Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin 2015;65:5-29.

2) Hecht SS. Tobacco smoke carcinogens and lung cancer. J Natl Cancer Inst 1999;91:1194-210.

3) Couraud S, Zalcman G, Milleron B, Morin F, Souquet PJ. Lung cancer in never smokers--a review. Eur J Cancer 2012;48:1299-311.

4) Prietl B, Treiber G, Pieber TR, Amrein K. Vitamin D and immune function. Nutrients 2013;5:2502-21.

5) Tannetta DS, Redman CW, Sargent IL. Investigation of the actin scavenging system in pre-eclampsia Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2014;172:32-5.

6) Eloranta JJ, Wenger C, Mwinyi J, Hiller C, Gubler C, Vavricka SR, et al. Association of a common vitamin D-binding protein polymorphism with inflammatory bowel disease. Pharmacogenet Genomics 2011;21:559-64.

7) Chishimba L, Thickett DR, Stockley RA, Wood AM. The vitamin D axis in the lung: a key role for vitamin D-binding protein. Thorax 2010;65:456-62.

8) Bishnoi RJ, Palmer RF, Royall DR. Vitamin D binding protein as a serum biomarker of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis 2015;43:37-45.

9) Lee SW, Chuang TY, Huang HH, Lee KF, Chen TT, Kao YH, et al. Interferon gamma polymorphisms associated with susceptibility to tuberculosis in a Han Taiwanese population. J Microbiol Immunol Infect 2015;48:376-80.

10) Moy KA, Mondul AM, Zhang H, Weinstein SH, Wheeler W, Chung CC, et al. Genome-wide association study of circulating vitamin D–binding protein. Am J Clin Nutr 2014;99:1424-31.

11) Feldman D, Krishnan AV, Swami S, Giovannucci E, Feldman BJ. The role of vitamin D in reducing cancer risk and progression. Nat Rev Cancer 2014;14:342-57.

12) Garland CF, Garland FC, Gorham ED, Lipkin M, Newmark H, Mohr SB, et al. The role of vitamin D in cancer prevention. Am J Public Health 2006;96:252-61.

13) Lee SW, Chuang TY, Huang HH, Lee KF, Chen TT, Kao YH, et al. Interferon gamma polymorphisms associated with susceptibility to tuberculosis in a Han Taiwanese population. J Microbiol Immunol Infect 2015;48:376-80.

14) Maneechay W, Boonpipattanapong T, Kanngurn S, Puttawibul P, Geater SL, Sangkhathat S. Single nucleotide polymorphisms in the Gc gene for vitamin D binding protein in common cancers in Thailand. Asian Pac J Cancer Prev 2015;16:3339-44.

15) Reimers LL, Crew KD, Bradshaw PT, Santella RM, Steck SE, Sirosh I, et al. Vitamin D-related gene polymorphisms, plasma 25-hydroxyvitamin D, and breast cancer risk. Cancer Causes Control 2015;26:187-203.

16) Kidd LC, Paltoo DN, Wang S, Chen W, Akereyeni F, Isaacs W, et al. Sequence variation within the 5' regulatory regions of the vitamin D binding protein and receptor genes and prostate cancer risk. Prostate 2005;64:272-82.

17) Corder EH, Friedman GD, Vogelman JH, Orentreich N. Seasonal variation in vitamin D, vitamin D-binding protein, and dehydroepiandrosterone: risk of prostate cancer in black and white men. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1995;4:655-9.

18) Poynter JN, Jacobs ET, Figueiredo JC, Lee WH, Conti DV, Campbell PT, et al. Genetic variation in the vitamin D receptor (VDR) and the vitamin D-binding protein (GC) and risk for colorectal cancer: results from the Colon Cancer Family Registry. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2010;19:525-36.

19) Mahmoudi T, Karimi K, Arkani M, Farahani H, Nobakht H, Dabiri R, et al. Lack of associations between Vitamin D metabolism-related gene variants and risk of colorectal cancer. Asian Pac J Cancer Prev 2014;15:957-61.

20) Flohil SC, de Vries E, van Meurs JB, Fang Y, Stricker BH, Uitterlinden AG, et al. Vitamin D-binding protein polymorphisms are not associated with development of (multiple) basal cell carcinomas. Exp Dermatol 2010;19:1103-5.

21) Schäfer A, Emmert S, Kruppa J, Schubert S, Tzvetkov M, Mössner R, et al. No association of vitamin D metabolismrelated polymorphisms and melanoma risk as well as melanoma prognosis: a case-control study. Arch Dermatol Res 2012;304:353-61.

22) McCullough ML, Bostick RM, Mayo TL. Vitamin D gene pathway polymorphisms and risk of colorectal, breast, and prostate cancer. Annu Rev Nutr 2009;29:111-32.

23) Soyyigit S, Baykara O, Buyru N, Erk M. VDBP gene polymorphism in COPD. Med Science 2013;2:403-13.

24) Gaensslen RE, Bell SC, Lee HC. Distributions of genetic markers in United States populations: III. Serum group systems and hemoglobin variants. J Forensic Sci 1987;32:1754-74.