Abstract

Methods: Thirty male Wistar albino rats weighing 200-300 gr were used in this study. The rats were divided into two groups as the control group and the study group. Osteotomy was performed on same region in each rat. Blood samples were obtained from each rat for biochemical studies and bone X-rays were taken. Human amniotic fluid was applied on the osteotomy line in the study group. The rats were sacrified at 1^th, 2^nd, and 4^th weeks. Tissue samples were examined histopathologically.

Results: No statistically significant differences were found between the groups in the histopathologic examinations, although the differences in some biochemical parameters were statistically significant. There were also no significant differences between the X-ray results.

Conclusion: The human amniotic fluid can be considered as an alternative agent, which is easy to provide and apply also can be used to improve fracture healing.

Methods

Deney grupları
Denek olarak sıçan seçilmesinin nedeni sıçanların, laboratuvar ortamında kolayca üretilebilen ve denek sayısı yönünden sıkıntı çekilmeyen hayvan olmaları, anatomik olarak sternum ve kotlarının mikrocerrahiye gereksinim olmadan ortaya konulabilmesi ve cerrahi işlemin kolay olmasıdır. Deneklerde alerjen olup olmadığını anlamak için çalışma öncesi beş adet deneğin cilt altına 0.1 cc İAS enjekte edildi. Hiçbir denekte erken dönemde ve 24 saat sonraki kontrolde alerjik reaksiyon gözlenmedi.

Tüm deneklerin sternumları üzerinde 4. kot hizasında transvers osteotomi oluşturulduktan sonra birinci grupta yer alan deneklere hiçbir işlem uygulanmadı. Bu grup İAS'nin kemik iyileşmesi üzerine etkisinin değerlendirilerek karşılaştırmanın yapılacağı kontrol grubu olarak kabul edildi. İkinci grupta yer alan deneklerin osteotomi hattına 0.2 cc İAS verildi ve bu grup deney grubu olarak kabul edildi. Her iki gruptan dörder denek 1. haftanın sonunda, dörder denek 2. haftanın sonunda ve yedişer denek de 4. haftanın sonunda sakrifiye edildi.

Cerrahi yöntem
Tüm denekler aynı deneysel şartlara tabi tutuldu ve ameliyattan dört saat önce aç bırakıldı. İndüksiyon anestezisi 90 mg/kg ketamin (Ketalar^®, Eczacıbaşı^®, İstanbul, Türkiye) ve 10 mg/kg ksilazin intraperitoneal uygulanarak sağlandı. Deneklere supin pozisyon verilerek göğüs ön duvarları tıraş edildi ve %10'luk povidon iyot solüsyonu ile boyandı (Batticon; Adeka, Samsun, Turkey). Midsternal cilt insizyonunu takiben cilt altı geçilerek pektoral kaslara ulaşıldı ve bu kas tabakası iki taraflı olarak dekole edilerek sternum ortaya kondu. Sternuma, 4. kotların eklem yaptığı seviyeden makas yardımıyla transvers osteotomi uygulandı. Osteotomi hattı denek gruplarına uygun olarak belirtilen şekilde işlemden geçirildikten sonra pektoral kaslar 3/0 poliglaktin sütür ile yaklaştırıldı ve cilt 2/0 poliprolen sütür ile kapatıldı.

Histopatolojik inceleme
Sternum üzerinde oluşturulan osteotomi hattının iyileşmesini değerlendirmek amacıyla tüm denekler 1, 2. ve 4. haftanın sonunda servikal dislokasyon yöntemi ile sakrifiye edildi. Tüm deneklerin sternumu, osteotomi hattı içinde olacak şekilde çıkarılarak %10'luk tamponlu formaldehit solüsyonuna konuldu. Kırık hattını içeren örneklenmiş kısımlar dekalsifikasyon işlemi için tamponlu formik asite alındı. Rutin takip işlemlerinden sonra parafine gömülen dokulardan elde edilen 4 μm'lik kesitler hematoksilin eosin boyası ile boyandı. Deneklere ne uygulandığını bilmeyen tek bir patolog tarafından ışık mikroskobu altında yapılan incelemede osteotomi hattındaki iyileşmenin değerlendirilmesi sayısal histolojik skorlama sistemi kullanılarak yapıldı.

Biyokimyasal inceleme
Çalışmaya alınan deneklerden ameliyat öncesinde grup bağımsız olacak şekilde rasgele 10 denekten intrakardiyak kanül girişimi ile kan örnekleri alınarak parathormon (PTH), Mg, P, Ca ve hidroksiprolin (HP) değerleri incelendi ve normal değerler elde edildi. Sakrifikasyon sonrası tüm deneklerden intrakardiyak kanül girişimi ile kan örnekleri alındı. Kontrol grubu ve denek grubundan alınan kan örnekleri santrifüj edildi ve elde edilen serum örnekleri –80 °C'de saklandı. Deney ve kontrol grubuna ait serum örneklerinin biyokimyasal analizi ile elde edilen PTH, Mg, P, Ca ve hidroksiprolin değerleri normal olarak kabul edilen değerler ile karşılaştırıldı.

Radyolojik inceleme
Tüm deneklere ameliyat sonrası, sternum görünecek şekilde X-ray grafi çekildi. Osteotomi hattında sternum üst ve alt periost çizgileri ve kalsifikasyon oluşumu yönünden radyolojik değerlendirmeden geçirildi.

İnsan amniyon sıvısının toplanması
İnsan amniyon sıvısı, Fakülte bünyesinde bulunan Kadın Hastalıkları ve Doğum Kliniği'nde prenatal tanı amaçlı olarak gebeliğin 16-20. haftalarında uygulanan amniyosentezlerden 2 cc olacak şekilde ve steril koşullarda toplandı. İşlem öncesi tüm hastalar sözel olarak bilgilendirildi ve razı olduklarına dair onam belgesi alındı. İnsan amniyon sıvısı kullanılmadan önce –80 °C'de saklandı ve kullanılacağı zaman oda havasında kendiliğinden çözünmesi sağlandı. Sıvının toplanması ile topikal olarak kullanılması arasında geçen sürenin bir haftadan fazla olmamasına özen gösterildi.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizlerde Windows için SPSS (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) 16.0 versiyon paket program kullanıldı. Deney ve kontrol gruplarındaki kırık hattı iyileşmesinin belirlenmesinde kullanılan histopatolojik değerlendirme skorlama değerleri arasında anlamlılık olup olmadığını ortaya koymak için Pearson ki-kare testi, biyokimyasal verilerin karşılaştırılmasında ise Mann-Whitney U-testi kullanıldı. İstatistiksel olarak p<0.05 olduğunda aradaki fark anlamlı kabul edildi.

Results

Tablo 1: Kırık hattı iyileşmesinde kullanılan histolojik sayısal skorlama değerlendirme sistemi

Tablo 2: Haftalara göre histopatolojik sayısal skorlama değerleri

Birinci hafta sonunda gruplar arası biyokimyasal parametreler referans değerler göze alınarak istatistiksel olarak değerlendirildiğinde, PTH ve Ca değerleri arasındaki fark her iki grup için de istatistiksel olarak anlamlı bulundu (sırasıyla; p=0.002, p=0.002, p=0.002, p=0.024). Parathormon değerlerindeki anlamlılık düşüklük olarak, Ca değerlerindeki anlamlılık ise yükselme olarak gözlendi (Tablo 4).

Tablo 3: Ameliyat öncesi grup, bağımsız biyokimyasal parametre örnekleri (referans değerler)

Tablo 4: Biyokimyasal veri sonuçları birinci hafta

İkinci hafta sonundaki biyokimyasal değerler karşılaştırıldığında kontrol grubunda PTH ve HP değerlerinde istatistiksel anlamlılık bulundu (p=0.024-0.008). Parathormon değerlerinde düşüklük, HP değerlerinde yükseklik olarak tespit edildi (Tablo 5).

Tablo 5: Biyokimyasal veri sonuçları ikinci hafta

İkinci hafta sonunda PTH ve HP dışındaki biyokimyasal değerler ile 4. hafta sonundaki biyokimyasal değerler karşılaştırıldığında aradaki farklar istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (Tablo 6).

Tablo 6: Biyokimyasal veri sonuçları dördüncü hafta

Tüm gruplarda haftalara göre biyokimyasal parametrelerin karşılaştırılmaları sonucu elde edilen p değerleri tablo 7'de belirtilmiştir.

Tablo 7: Mann-Whitney U-testi sonucuna göre gruplar arası biyokimyasal parametlerin p değerleri

Deneklere çekilen röntgenler değerlendirildiğinde ameliyat sonrası erken dönem, 1, 2. ve 4. haftalar arasında görünüm olarak sternum üst ve alt periost çizgileri ve kalsifikasyon oluşumu arasında farklılıklar tespit edilemedi (Şekil 1).

Şekil 1: Ameliyat sonrası 1. gün, 1., 2. ve 4. haftada röntgen görüntüsü.

Discussion

Kırık iyileşmesi üç evreye ayrılır: Bu evreler birbiri ile ilişkilidir ve geçici olarak birbiri ile iç içe girebilir.[3,4] Kırık oluşumu ile birlikte o bölgede inflamasyon başlar ve yaklaşık olarak 2-3 hafta devam eder.[2-5] Kemiğin rejenerasyonunda, PTH, kalsitonin, vitamin D metabolitleri ve alkalin fosfataz gibi birçok faktör rol oynar ve bunların kan plazmalarındaki seviyeleri artar. Kırık hattında hematom oluşur. Hematomla birlikte kırık bölgesine gelen fibroblastlar da kollajen salgılayarak, kırık uçlarını kollajen liflerle birbirine bağlar.[2,3,6]

Kırık iyileşmesinin iki ya da üçüncü gününde kırık bölgesinde periost ve endosttan köken alan osteoblast ve kondroblastlarda hızlı bir çoğalma görülür.[2-4,7,8] Kırık iyileşmesinin ikinci aşaması yenilenme fazıdır. Osteogenezis devam eder ve kırık bölgesinde köprü kallus oluşumu sürer.[3,9]

Oluşan kallus serttir ancak hala dayanıksızdır. Böylece kırık uçları arasındaki stabilite artar. Stabilitenin artması ile fibrokartilajenöz kallusun oluşumunda primer rol oynayan kan damarları medullada yeniden şekillenmeye başlar. Aynı zamanda periost ve endost kökenli osteoblastlar kemik matriksi olan osteoidin yapımına başlar. Ön kallusun yerini yavaş yavaş kemiksi kallus alır. Bu aşamaya 4-6 haftada ulaşılır. Artık kemik kaynaması oluşmuştur.[2-6,10]

Kırık, kallus ile köprülendiği zaman yeniden şekillenme aşaması başlar. Oluşan büyük kırık kallusu normal kemik iliği boyutuna ulaşıncaya kadar osteoklastlar tarafından yıkılır. Bunun sonucunda, havers sistemi bulunan lameller kemik yapısı oluşur. Bu süreç yıllar boyunca devam edebilir.[3-5,7,8,10]

Göğüs ön duvarı stabilizasyonu temel olarak iki faktöre bağlıdır. Birincisi; deforme olan ve çıkarılan kostal kartilajların rejenerasyonu, ikincisi; rezeke edilen sternumun psödoartroz olmadan kaynamasıdır. Kostal kartilaj rejenerasyonu en erken olarak 21 günde başlar, sternumun kaynaması üç aylık zaman gerektirir. Bundan dolayı göğüs duvarı stabilizasyonu için gereken süre en az üç aydır. Uzun bir süre olması ve hareket kısıtlılığı gerektirmesinden dolayı, hastalar tarafından tolere edilemeyebilir ve sonuçta rekürens gelişmesine neden olabilir. Bir başka sorun da deforme olan ve rezeke edilen kıkırdak kot yataklarında fibröz doku gelişmesi ve toraks duvar esnekliğinin bozulmasıdır. Göğüs duvarı hareketli ve esnek bir yapıdır, bu esnek yapının bozulması akciğer ekspansiyonuna engel durum teşkil edebilir. Bu nedenden dolayı birçok araştırmacı kostal kartilajların tamamen değil, parsiyel rezeke edilmesini ve kıkırdak büyüme hattı olan kostokondral bileşkede kıkırdak yapısının korunması gerektiğini vurgulamışlardır.[6]

Günümüzde pektus cerrahisi için birçok teknik kullanılmaktadır. Birçok teknikte, deforme kıkırdaklar çıkarılır ve sternuma uygun yerlerine wedge veya osteotomi şeklinde rezeksiyon uygulanır.[1] Sternum stabilizasyonunda teknikler arasında farklılıklar vardır. Burada esas olan sternumun stabilizasyonunun çok iyi yapılmasıdır.

Çalışmamızda insanlardan alınan İAS kullanıldı. Tavşana ait amniyon sıvısı yerine insan amniyon sıvısı kullanmamızın nedenleri; İAS içerisinde büyüme faktörleri, ekstraselüler matriks proteinlerine ait prekürsörler, hyalüronik asit (HA) ve hyalüronik asit-stimülan aktivatörün (HASA) varlığı ve miktarının daha önceki çalışmalar ile gösterilmiş olması,[11] prenatal tanı işlemleri arasında yer alan amniyosentez işleminin kadın hastalıkları ve doğum kliniği'nde yaygın olarak yapılan bir işlem olmasından dolayı İAS elde etmenin kolay olması, buna benzer tavşan kullanılarak yapılan deneysel çalışma modellerinde İAS'ye karşı herhangi bir hücresel immün yanıtın gelişmediğinin gösterilmiş olması[11-14] ve tavşan amniyosentezinin zor elde edilmesi ve alınan miktarın yeterli olamamasıdır.

İnsan amniyon sıvısı sterildir. İkinci trimesterde İAS'de IgG seviyesi en üst düzeydedir, bundan dolayı virüs, bakteri, mikoplazma, mantar veya klamidya gibi mikroorganizmalar üreyecek ortam bulamazlar.[11-14]

Yapılan çalışmalar neticesinde, birçok büyüme faktörünün ve ekstraselüler matriks proteinlerinin osteositlerin büyüme ve farklılaşması üzerine olumlu etkisi olduğu bulunmuştur. İnsan amniyon sıvısı özellikle ikinci trimesterde bu proteinleri yoğun olarak içermektedir. Ekstraselüler matriks bileşenleri kemik veya yumuşak doku zedelenmesinin iyileşmesinde önemli rol oynar. Özellikle kondroitin sülfat osteoindüktif aktivite göstermeksizin osteojenik etki gösterir. İnsan amniyon sıvısı içerdiği bileşenlerden dolayı kemik iyileşmesini subperikondriyal uygulama sonrası artırıcı etki gösterir ve içinde yoğun şekilde HA, HASA ve diğer ekstraselüler matriks bileşenlerini bulundurur.[13,14] Yapılan birçok deneysel çalışmada İAS'nin özellikle kıkırdak ve kemik rejenerasyonunda pozitif etkili olduğu vurgulanmıştır.[15-17]

Bizim çalışmamızda histopatolojik değerlendirme skorlaması sonucu elde edilen değerlerde istatistiksel olarak hiçbir grupta anlamlı sonuç bulunamadı. Ancak gruplarda elde edilen histopatolojik değerler incelendiğinde istatistiksel olarak anlamlı olmasa da değer bazında kemik iyileşmesi üzerine pozitif etkili olduğu söylenebilir.

Kemik iyileşmesi için günümüzde greftler veya değişik materyaller kullanılmaktadır. Bu maddelerin kemik iyileşmesi üzerine etkileri osteogenezis, osteoindüksiyon veya osteokonstrüksiyon şeklinde olur.

Parçalı veya defektli kemik kırıklarında günümüzde birçok greft materyali kullanılmaktadır. Kullanılan bu greftlerin avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Avantajları ve dezavantajları değerlendirildiğinde, greft materyallerinin kullanım oranları azalmıştır. Otogreftlerin yerine kullanılabilecek çok sayıda allojenik ve ksenojenik kemik greft materyalinin değişik yöntemler kullanılarak hazırlanmasıyla da, şiddetli immünolojik yanıt gösteren ksenogreftler dışında, doğal greft materyallerinin pek çok çeşidi kullanım alanı bulmuştur. Ayrıca, çeşitli yöntemlerle elde edilen otolog ve allojenik kemik greft materyallerinin kullanılması ve uygun koşullarda saklanması amacıyla doku bankaları da kurulmuştur. Ancak, doku bankaları kurulması zor ve pahalı kurumlar olmakla birlikte, donör seçimi, elde edilen dokunun hazırlanması, sterilizasyonu ve allogreftlerin uygun koşullarda saklanması gibi konularda da halen kullanılmakta olan kesin bir protokol bulunmamaktadır. Bu gelişmelerin yanı sıra, son yıllarda allogreftlerin de bazı dezavantajlarının gözlenmesi, çalışmaların yapay greft materyalleri ve osteojenik materyaller üzerinde yoğunlaşmasına neden olmuştur.[18-21]

Hidroksiapatit en çok denenen ve farklı görüşlerin ortaya atıldığı malzemedir.[18-24]

Hidroksiapatit, doğal kemik yapısında da bulunan kalsiyum ve fosfat iyonlarından oluşmaktadır. Yapısının kemiğe benzerlik göstermesi bu materyalin klinik başarısında etkin bir faktördür. Hidroksiapatit üzerinde yapılan çalışmalarda, yeni kemiğin implant yüzeyinde değil, kemikten ve osteogenezis özelliği olan periferal mezenkimal hücrelerden partiküller arasına doğru oluştuğu belirtilmiştir.[23,24] Hidroksiapatitin osteoindüktif özelliği olmamasına karşın, kemik gelişimini yönlendirici özellikler gösterdiği öne sürülmektedir. Gelişmekte olan kemiği partiküller arası boşluğa doğru yönlendirerek bu işlevi görmektedir. Bu özelliği birçok araştırmacı tarafından osteokondüktif veya osteofilik olarak ifade edilmiştir.[19-24]

Bunların dışında cyclooxygenase-2 inhibitör, ethanol, kalsitonin, diklofenak-sodyum gibi materyaller deneysel çalışmalarda kullanılmış ve sonuç olarak farklı görüşler ortaya çıkmıştır.[26-30]

Sıçan kanında bulunan PTH, Mg, Ca, P ve HP düzeyleri hakkında bilgi olmadığı için, referans değer elde edebilmek için çalışma öncesi gruplardan bağımsız rasgele seçilen 10 denekten kan örnekleri alındı. Elde edilen biyokimyasal değerler, gruplar arası karşılaştırmada referans değer olarak kullanıldı.

Parathormon paratiroid bezleri tarafından üretilen, polipeptid yapısındaki hormondur. Vücutta kalsiyum metabolizmasını ayarlayan en önemli hormondur. Parathormonun, osteoklast sayısını artırıcı, kemiğin yeniden şekillenmesini uyarıcı ve osteositleri uyararak osteolizi hızlandırıcı etkileri vardır. İnsülin ve büyüme hormonu gibi anabolizan hormonlar kırık iyileşmesini hızlandırmaktadır. Büyüme hormonu ve diğer anabolizan hormonlar, proteine bağlı kalsiyum artışını etkileyerek kırık iyileşmesine yardımcı olur. Büyüme hormonu, kallus hacminde artışa neden olur.[2,3]

Hidroksiprolin, prolin türevidir, bitki hücre duvarı proteinlerinde ve bağ dokusunun fibröz proteini olan kollajende bulunur. Kemik kollajeninin yapısındaki önemli bir maddedir. Biyokimyasal değer olarak önemi; vücutta kemik kollajen döngüsünü gösterir. Kemik rezorbsiyonu için iyi bir göstergedir.[2,3]

Kemik iyileşmesi sırasında normalde birkaç gün içinde inflamasyon ve osteoklastik aktivite artışına bağlı olarak, belirtilen parametrelerde fazla değişiklik beklenmez. Ancak bizim çalışmamızda birinci hafta sonunda bakılan örneklerde her iki grupta da PTH değerinde düşme gözlendi. Kalsiyum değerlerinde 1. hafta sonunda osteoklastik aktivasyona paralel olarak yükselme gözlendi. Birinci hafta sonunda meydana gelen biyokimyasal parametre değişiklikleri normal kemik iyileşmesi sırasında beklenen değişikliklerle paralellik göstermedi.

Kırık iyileşmesinin tamir dönemine tekabül eden ikinci haftada PTH, Ca ve HP değerlerinde fazla olmamakla birlikte yükseklik, P değerinde göreceli düşüklük olması beklenir. Bizim çalışmamızda ise bu sürede biyokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi incelendiğinde, ilginç olarak kontrol grubunda PTH değerinde, çalışma grubunda ise HP değerlerinde anlamlı düşüklük gözlendi.

Kallus oluşma dönemi genellikle kırık olan kemiğin yapısal özelliklerine bağlı olarak değişmekle birlikte kabaca 4. haftadan sonra başlar. Bu dönemde biyokimyasal parametrelerde PTH, HP, Ca değerlerinde artış, P değerinde düşme Mg değerinde ise farklı değişiklikler olması beklenir. Bizim çalışmamızda hiçbir parametrede istatistiksel olarak anlamlı değişiklik gözlenmedi, ancak parametrelerin değerlerine bakıldığında göreceli de olsa literatür bilgilerine paralel değişiklikler gözlendi.

X-ray incelemeler genellikle kal oluşum evresi olan 3-4 hafta sonra anlamlıdır. Bizim çalışmamızda deneklere çekilen X-ray incelemelerde; osteotomi hattında sternum üst ve alt periost çizgileri ve kalsifikasyon oluşumu yönünden gruplar arasında radyografik görüntüler açısından farklılık tespit edilmedi.

Sonuç olarak, yaptığımız çalışma ile İAS'nin kemik iyileşmesinde pozitif etki gösterdiği, bazı biyokimyasal parametrelerde osteotomi hattının iyileştiğini belirleyen anlamlılık tespit edildi. Diğer parametrelerde istatistiksel anlamlılık olmasa da iyileşme üzerinde olumlu katkı sağlayabileceği düşüncesi ile bu konuda daha geniş katılımlı çalışmalara gereksinim vardır. Bu veriler doğrultusunda, elde ettiğimiz histopatolojik ve biyokimyasal değerler incelendiğinde; insan amniyon sıvısı temini ve uygulanabilirliğinin kolay olması nedeni ile kırık iyileşmesinde kullanılabilecek alternatif ajanlar arasında değerlendirilebilir. Ancak bu konuyu daha net olarak ortaya koyabilecek daha detaylı çalışmalara gerek olduğu kanısındayız.

Çıkar çakışması beyanı
Yazarlar bu yazının hazırlanması ve yayınlanması aşamasında herhangi bir çıkar çakışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Finansman
Yazarlar bu yazının araştırma ve yazarlık sürecinde herhangi bir finansal destek almadıklarını beyan etmişlerdir.

References

1) Genc O, Gurkok S, Gözübüyük A, Dakak M, Caylak H, Yücel O. Repair of pectus deformities: experience and outcome in 317 cases. Ann Saudi Med 2006;26:370-4.

2) Robbins SL, Kumar V, editors. Basic pathology. 4th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co.; 1987. Robins SL, Kumar V. Kemik onarımı. Çeviri editörü: Uluoğlu Ö. Patoloji. Ankara: Güneş Kitabevi; 1990. s. 65-6.

3) Brown SG, Kramers PC. Indirect (secondary) bone healing. In: Bojrab MJ, editor. Disease mechanisms in small animal surgery. 2nd ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1993. p. 671-7.

4) Remedios A. Bone and bone healing. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1999;29:1029-44.

5) Hulse D, Hyman B. Fracture biology and biomechanics. In: Slatter D, editor. Textbook of small animal surgery. 2nd ed. Philadephia: W.B. Saunders; 1993. p. 1595-603.

6) Johnson AL, Eurell JC, Losonsky JM, Egger EL. Biomechanics and biology of fracture healing with external skeletal fixation. Compend Contin Educ Pract Vet 1998;20:487-502.

7) Denny HR, Butterworth S. Fracture healing. In: Denny HR, Butterworth S, editors. A guide to canine and feline orthopaedic surgery. 4th ed. London: Blackwell Seince; 2000. p. 3-17.

8) Skerry TM. Fracture healing. In: Coughlan AR, Miller A, editors. Bsava manual of small animal fracture repair and management. 1st ed. England: BSAVA; 1998. p. 29-42.

9) Perren SM. Primary bone healing. In: Smeak DD, Bojrab MJ, Bloomberg MS, editor. Disease mechanisms in small animal surgery. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 1993. p. 663-70.

10) Noyan A. Kemik dokusu ve kemikleşme. In: Noyan A, editör. Yaşamda ve hekimlikte fizyoloji. 10. baskı. Ankara: Meteksan Yayınları; 1998. p. 1046-7.

11) Burd DA, Greco RM, Regauer S, Longaker MT, Siebert JW, Garg HG. Hyaluronan and wound healing: a new perspective. Br J Plast Surg 1991;44:579-84.

12) Michalsky MP, Lara-Marquez M, Chun L, Besner GE. Heparin-binding EGF-like growth factor is present in human amniotic fluid and breast milk. J Pediatr Surg 2002;37:1-6.

13) Dahl LB, Kimpton WG, Cahill RN, Brown TJ, Fraser RE. The origin and fate of hyaluronan in amniotic fluid. J Dev Physiol 1989;12:209-18.

14) Longaker MT, Adzick NS, Hall JL, Stair SE, Crombleholme TM, Duncan BW, et al. Studies in fetal wound healing, VII. Fetal wound healing may be modulated by hyaluronic acid stimulating activity in amniotic fluid. J Pediatr Surg 1990;25:430-3.

15) Ozgenel GY, Samli B, Ozcan M. Effects of human amniotic fluid on peritendinous adhesion formation and tendon healing after flexor tendon surgery in rabbits. J Hand Surg Am 2001;26:332-9.

16) Kerimoğlu S, Livaoğlu M, Sönmez B, Yuluğ E, Aynaci O, Topbas M, et al. Effects of human amniotic fluid on fracture healing in rat tibia. J Surg Res 2009;152:281-7.

17) Ozgenel GY, Filiz G, Ozcan M. Effects of human amniotic fluid on cartilage regeneration from free perichondrial grafts in rabbits. Br J Plast Surg 2004;57:423-8.

18) Karaçal N, Koşucu P, Cobanglu U, Kutlu N. Effect of human amniotic fluid on bone healing. J Surg Res 2005; 129:283-7.

19) Develioglu H, Unver Saraydin S, Kartal U. The bone-healing effect of a xenograft in a rat calvarial defect model. Dent Mater J 2009;28:396-400.

20) Jacobsson SA, Djerf K, Ivarsson I, Wahlström O. Effect of diclofenac on fixation of hydroxyapatite-coated implants. An experimental study. J Bone Joint Surg [Br] 1994;76:831-3.

21) Özcan A, Yüncü M, Dalkız M, Yapar M. Kemik defektlerinin iyileşmesinde Hidroksilapatitin etkisinin değerlendirilmesi (Deneysel çalışma). T Klin Diş Hek Bil 2000;6:138-44.

22) Overgaard S, Søballe K, Lind M, Bünger C. Resorption of hydroxyapatite and fluorapatite coatings in man. An experimental study in trabecular bone. J Bone Joint Surg [Br] 1997;79:654-9.

23) Wang G, Yang H, Li M, Lu S, Chen X, Cai X. The use of silk fibroin/hydroxyapatite composite co-cultured with rabbit bone-marrow stromal cells in the healing of a segmental bone defect. J Bone Joint Surg [Br] 2010;92:320-5.

24) Benlidayi ME, Kürkcü M, Oz IA, Sertdemir Y. Comparison of two different forms of bovine-derived hydroxyapatite in sinus augmentation and simultaneous implant placement: an experimental study. Int J Oral Maxillofac Implants 2009; 24:704-11.

25) Canettieri AC, Colombo CE, Chin CM, Faig-Leite H. Femur bone repair in ovariectomized rats under the local action of alendronate, hydroxyapatite and the association of alendronate and hydroxyapatite. Int J Exp Pathol 2009;90:520-6.

26) Herbenick MA, Sprott D, Stills H, Lawless M. Effects of a cyclooxygenase 2 inhibitor on fracture healing in a rat model. Am J Orthop (Belle Mead NJ) 2008;37:E133-7.

27) Nyquist F, Halvorsen V, Madsen JE, Nordsletten L, Obrant KJ. Ethanol and its effects on fracture healing and bone mass in male rats. Acta Orthop Scand 1999;70:212-6.

28) Esenyel M, Bülbül M, Esenyel CZ, Kara AN, Bilgiç B. Kalsitoninin kırık iyileşmesi üzerine etkisi: histopatolojik ve radyografik deneysel çalışma. Türk Fiz Tıp Rehab Derg 2005;51:6-8.

29) Bulbul M, Esenyel CZ, Esenyel M, Ayanoglu S, Bilgic B, Gulmez T. Effects of calcitonin on the biomechanics, histopathology, and radiography of callus formation in rats. J Orthop Sci 2008;13:136-44.

30) Akman Ş, Göğüş A, Şener N, Bilgiç B, Aksoy B. Sıçan tibya kırıkları sonrası uygulanan diklofenak-sodyumun kırık kaynaması üzerine etkileri: deneysel çalışma. Hacettepe Ortopedi Dergisi 2001;11:55-60.