Changes of the Erythrocyte Membrane Adenosine- 5Triphosphatase Activities in the Prosthetic Heart Valve Replaced Patients at Postoperative Period and Interrelations of These Changes with Hemolysis

Changes of the Erythrocyte Membrane Adenosine- 5Triphosphatase Activities in the Prosthetic Heart Valve Replaced Patients at Postoperative Period and Interrelations of These Changes with Hemolysis

Orhan Kemal SALİH, Şekip Kazım ÇELİK, Mustafa Kemal OSKAY, Lülüfer TAMER

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Kalp Damar Cerrahisi ve Biyokimya Anabilim Dalı, SSK Mersin Hastanesi Göğüs Kalp Damar Cerrahisi

Abstract

In this study erythrocyte membrane ATPase enzyme activity changes and hemolysis developed in the postoperative period after replacement of the same type of prosthetic heart valves were investigated in twenty patients. The findings were compared with the values obtained from ten healthy people. Hemolysis was not observed in the preoperative period of the patient group; but mild degree of hemolysis was detected in the fourth and the eighth months of the postoperative period. Although no hemolysis occured in the patient group at the preoperative period, a significant decrease was observed in each of three ATPase enzyme activities as compared to the control group. At the fourth and the eighth months of postoperative period, there were significant decreases in the ATPase enzyme activities with mild hemolysis when compared to preoperative period. These results indicated that the ATPase enzyme activities decreased in the patient group could not be directly related with hemolysis and some other factors might contribute to the loss enzyme activities.

Abstract

Açık kalp cerrahisinde protez kapak replasmanları yaygın şekilde uygulanmaktadır. Başlangıçta çeşitli dizayn ve materyal problemlerinin yanısıra hemolizde büyük sorun olarak ortaya çıkmıştır. Sonraki yıllarda ise dizayn, kullanılan materyal ve hidrolik performans üzerinde yapılan çalışmalarda optimale yakın yapı ve akım özellikleri olan yapay kapaklar imal edilerek hemoliz de en aza indirilmiştir. Öyle ki, son zamanlarda klinik olarak hemolize rastlanmadığı bildirilmiştir (1). Klinik olarak hemolitik anemi belirtileri ortaya çıkmasa da kapak replasmanı yapılan hastalarda bir miktar intravasküler hemoliz vardır. Diğer nedenler bir tarafa bırakılacak olsa bile yapay kapağın eritrositlere olan sürekli travma etkisi (çekiç etkisi) hemoliz nedeni olarak kabul edilmektedir. Normalde oldukça elastik ve travmaya dayanıklı bir yapısı olan eritrositte bu travmanın eritrositin zar yapısı üzerinde hemolizi etkileyecek biyokimyasal bir değişiklik yaratıp yaratmadığı konusu henüz açıklığa kavuşturulmamıştır [2-4].

ATPaz enzim sistemi tüm hücre zarları gibi eritrosit zarında da bulunur ve zarda aktif iyon transportunu sağlar. Böylece hücre metabolizmasının devamlılığı, ozmotik dengesinin korunması ve zar stabilizasyonunu sağlayarak eritrosit bütünlüğünün korunmasında önemli rol oynar [5,6]. Bu nedenle, kapak replasmanı yapılan hastalarda sürekli travmaya maruz kalan eritrositlerde zarda bulunan ATPaz enzim aktivitesinde bir değişme olup olmadığı ve varsa zaman içinde bu değişimin intravasküler hemoliz ile ilişkisini araştırdık.

Methods

Kliniğimizde 1 yıl içinde kapak replasmanı yapılan hastalarda postoperatif dönemde karaciğer, böbrek, hemapoietik sistem ve diğer sistemlerde patoloji saptanmayan 20 olgu çalışma gruubu olarak alındı. Çalışma grubunu oluşturan bu hastaların yaş ortalaması 34.85±14 olup [13-59], 11i erkek, 9u kadındı. Bu hastaların hepsinde bileaflet mekanik kapak protezi kullanılmış olup, 10 hastaya mitral, 6 hastaya aort ve 4 hastaya da aort+mitral pozisyonda implantasyon yapıldı.

Kontrol grubunu ise hastane personelinden bilinen herhangi bir sistem hastalığı olmayan ve yaşları 31 ile 58 arasında değişen 7si erkek, 3ü kadın toplam 10 kişi oluşturdu. Araştırdığımız parametrelerin tayini için kan ve idrar örnekleri kontrol grubunu oluşturan olgulardan bir kez alındı. Hasta grubunu oluşturan olgulardan ise preoperatif dönemde bir kez, postoperatif dördüncü ayda bir kez ve postoperatif sekizinci ayda bir kez olmak üzere toplam üç kez alındı.

Kan örneklerinin alınması

Araştırma ve kontrol grubunu oluşturan, eritrosit zarında ATPaz enziminin spesifik aktivitesini ölçmek için kan örnekleri alındı. Bunun için her iki grupta antekubital venlerden daha önce heparinle yıkanmış enjektörle steril şartlarda 10 ml kan alınıp steril bir tüpe konarak, içinde buz bulunan ikinci bir kap aracılığıyla bir saat içinde süspansiyonu elde etmek için laboratuara götürüldü.

Eritrosit zarının hazırlanması Eritrosit zarının hazırlanmasında Beutler tarafından önerilen yöntem kullanıldı [7]. Bu yöntemle heparinize kan, kuru sellüloz (Sigma Tip 50) kolonundan 0.154 M NaCI kullanılarak geçirilip lökositlerin ayrılması temin edildi. Bu şekilde elde edilen eritrositler 0.154 M NaCI çözeltisi ile 1000 xgde 10 dakika çevrilmek suretiyle hazırlanan hemolizat stabilize edici çözeltiye (b-Merkaptoetanol % 10 ve 0.27 M EDTA Ph 7.4) alınarak eritrosit zarı hazır-lanmasında kullanıldı. Bu şekilde hazırlanan eritrosit süspansiyonu 35 ml 0.01 M TrisHCI Ph 7.4 ile muamele edilerek buz içerisinde 5 dakika bekletildikten sonra 30.000 xgde santrifüje edilip (en az iki defa) eritrosit zarı hazırlandı.

Eritrosit zarında ATPaz enzimi spesifiki aktivitesi tayini

ATPaz spesifik aktivitesi ortalama ilave edilen (eritrosit zarına) adenozin trifosfatın (ATP) hidrolizi ile açığa çıkan inorganik fosfatın (Pi) ölçülmesi ilkesine dayanmaktadır. Enzim spesifik aktivitesinin ölçülmesinde kullanılan inkubasyon ortamının hazırlanmasında ise Reading ve İsbir tarafından önerilen yöntem kullanılmıştır [8]. İnkubasyon ortamı 100 mM Na+, 5 mM K+, 5 mM MgCI2, 0.1 mM EDTA, 30 mM TricHCI Ph 7.4 ve 3 mM ATP ihtiva etmektedir. İnkubasyon ortamının iyonik kuvveti 144.1 mMdür. İnkubasyon işlemi 37°Cde 30 dakika olarak yürütüldü. Reaksiyonlar, karışımlar buz içine konarak durduruldu.

Reaksiyon sonucu açığa çıkan inorganik fosfat Atkinson ve ark. tarafından önerilen yönteme göre ölçüldü. Bu yöntemle inorganik fosfat, Lubral-molibdik asit ile vermiş olduğu kompleksin 390 nM dalga boyunda göstermiş olduğu absorbans şiddetinin ölçülmesi ile saptandı. İnorganik fosfat hesaplanmasında ise KH2PO4 kullanılarak hazırlanan standart eğri kullanıldı [9]Eritrosit zarı protein ölçümlerinde Lowry ve ark. önerdiği yöntem kullanıldı [10]. Protein değerlerinin hesaplanmasında ise bovin serum olbumin standart olarak kullanıldı. Eritrosit zarı ATPaz değerleri, enzimin bir saatte açığa çıkardığı fosfatın mg protein başına düşen miktarı olarak ifade edildi (nM Pi/mg protein/saat).

Hemoliz incelenmesi Hemoliz şiddetinin belirlenmesi oluşabilecek klinik tablonun tedavi açısından önemlidir. Aktivite kısıtlanmasından kan transfüzyonuna ve hatta reoperasyona kadar gidebilecek tedavi yöntemleri hemolizin şiddetine göre uygulanabilmektedir [11-13]. Bu konuda çeşitli sınıflandırma kriterleri mevcuttur [14,15]. Bunların ışığında hemoliz şiddetini tayin edebilmek için laktik dehidrogenaz (LDH), serum haptoglobulin, retikukositoz ve idrarda hemosiderin (he-mosiderinüri) değerleri ölçülmüştür.

LDH ölçümü

LDH, Technican RA-XT 10 cihazı ile taze plaz-madan çalışıldı. Brownın yöntemi kullanıldı [16]. LDH düzeyinin bu yöntemle normal değerleri 37°Cde 150-390 Ü/L kabul edildi.

Haptoglobulin ölçümü Dacie ve ark. [17] önerdiği biçimde Radial İmmun Diffüzyon (RID) yöntemi ile taze serumdan Human Haptoglobulin NL-RID Plate Code-RA 058 kiti ile çalışıldı. Buna göre serum haptoglobulin düzeyinin normal değerleri 40-200 mg/dl kabul edildi.

Retikülosit sayımı Retikülosit sayımı taze kan örnekleriyle çalışıldı ve Brownın [16] yöntemi ile retükülosit boyası olarak Parlak Krezil mavisi kullanılarak yapıldı.

Retikülosit sayısı: % retikülosittotal retikülosit sayısı/total eritrosit sayısı x 100 formülü ile hesaplandı. Bu yöntemle normal retikülosit oranı % 0.5-1.5 olarak kabul edildi.

İdrarda hemosiderin tayini

Williams ve ark. [18] önerdiği yöntem olan demirin potasyum ferrosiyanür içeren Prusya mavisi ile boyanması esasına dayanan yöntemle hemsiderinüri ölçümü yapıldı. İdrar sedimentinde yapılan yaymalar bu madde ile boyandıktan sonra mikroskopta immersiyon objektifi altında hemosiderin granüllerinin tayini kalitatif olarak yapıldı. Araştırmanın istatistiksel analizlerinde t testi veya alternatifi non-parametrik m-w ve Kruskall Wallis/varyans analizi kullanıldı. p değerinin 0.01 ve 0.05den küçük değerleri anlamlı kabul edildi.

Methods

Results

Hemoliz bulguları

Çalışmamızda kontrol grubunu oluşturan 10 olgu ile hasta grubunu oluşturan 20 olguya ait hemoliz parametrelerinden kalitatif olarak bakılan idrar hemosiderini hem kontrol hem de hasta grubunun her üç döneminden menfi () bulunmuştur (Tablo 1). Kontrol ve hasta grubunun kantitatif olarak çalışılan haptoglobulin, LDH ve retikülosit ortalama değerleri Tablo 2de verilmiştir.

Hemolizin şiddetinin belirlenmesinde faydalanılan kriterler

Hemoliz parametrelerinin kontrol ve hasta gruplarındaki ortalama değer ve bu değerlere göre hemolizin belirlenmesi

Haptoglobulin düzeyleri Tablo 2de görüldüğü gibi kontrol grubunda ortalama 120.3 mg/dl; hasta grubumda ise preoperatif dönemde 42.26 mg/dl, postoperatif 4. ayda 31.21 mg/dl, postoperatif 8. ayda 24.60 mg/dl olarak bulundu. Preoperatif dönemdeki değer kontrol grubuna göre anlamlı bir azalma göstermektedir (p<0.01). Bu azalma postoperatif 4. ay ve 8. aydaki değerlerde preoperatif değere göre yine anlamlı bir şekilde devam etmektedir (p<0.05, p<0.05) (Şekil 1).

Hastalara ait heptoglobulin değerlerinin değişimi ve kontrol grubu değerleriyle karşılaştırılması

LDH düzeyi kontrol grubunda ortalama 260.7 U/l; hasta grubunda ise preoperatif dönemde 272.3 U/L, postoperatif 4. ayda 584.1U/L,grubu değeri arasında anlamlı bir fark saptanmadı (p>0.05). Hasta grubunun postoperatif 4. aydaki LDH değerinde preoperatif dönemdeki LDH değerine göre anlamlı artış bulundu (p<0.01). Hasta grubunun postoperatif 4. ay ile 8. aydaki LDH değeri arasında istatistiki açıdan anlamlı bir fark saptanmadı (p>0.05) (Şekil 2).

LDH düzeyinin hasta grubunda değişimi ve kontrol gurubuyla karşılaştırılması

Retikülosit değerleri ortalama olarak kontrol grubuna % 0.94, hasta grubunda ise preoperatif dönemde %1.10, postoperatif 4. ayda % 1.39, postoperatif 8. ayda %1.78 bulundu. Hasta grubunun preoperatif değeri ile kontrol grubunun değeri arasında anlamlı fark yoktu (p>0.05). Ancak hasta grubunun postoperatif 4. aydaki değeri preoperatif döneme göre, 8. aydaki değeri de 4. ay değerine göre anlamlı şekilde artmış olarak tespit edildi (p<0.05 ve p<0.05) (Şekil 3).

Hasta grubu ile kontrol grubu retikülosit değerlerinin karşılaştırılması

Hasta grubuna ait preoperatif dönemlerdeki ATPaz aktivite değişimi ile kontro grubuna ait ATPaz aktiviteleri.

Bu bulgular ışığında hastalar hemoliz açısından değerlendirildiğinde, preoperatif dönemde hemoliz olmadığı, postoperatif 4. ayda hafif hemoliz ortaya çıktığı ve bu hemolizin postoperatif 8. ayda devam ettiği görüldü.

Araştırmada kontrol grubunu oluşturan olgularla hasta grubunun preoperatif, postoperatif 4. ayve postoperatif 8. ay dönemlerinde ATPaz enzim aktivitesi ölçülmüştür (Tablo 3).

Kontrol ve hasta gruplarına ait ATPaz enzim aktivitesi değerleri

Na+-K+ATPaz değerleri: Kontrol grubunda ortalama 576.1 nMol Pi/mg protein/saat iken hasta grubunda preoperatif dönemde 442.0 nMol Pi/mg protein/saat olarak ölçülmüş, bu ikisi arasındaki fark istatistiki açıdan anlamlı bulunmuştur (p<0.05). Hasta grubuna ait postoperatif 4. aydaki değer 402.3 nMol Pi/mg protein/saat olarak ölçülmüş, bu değere preoperatif dönem değerine göre anlamlı şekilde azalmış olarak tespit edilmiştir (p<0.01). Postoperatif 8. aydaki değer ise 344.05 nMol Pi/mg protein/saattir, bu değerin postoperatif 4. aydaki değere göre azalışı anlamlı bulunuştur (p<0.05).

Ca+2/Mg+2 ATPaz değerleri: Kontrol grubuna ait enzim aktivitesi 570.7; hasta grubu aktiviteleri; preoperatif dönemde 437.05, postoperatif 4. ayda 380.7, postoperatif 8. ayda ise 343.05 nMol Pi/mg protein/saat olarak ölçüldü. Hasta grubunun preoperatif değeri kontrol grubuna göre anlamlı azalma göstermektedir (p<0.05). Hasta grubunun postoperatif 4. ve 8. aydaki enzim aktivitelerindeki azalma preoperatif 4. ve 8. aydaki enzim aktivitelerindeki azalma preoperatif döneme göre anlamlıdır (p<0.05). Hasta grubunda postoperatif 4. ay ile preoperatif dönem ve postoperatif 8. ay ile 4. ay karşılaştırıldığında enzim değerlerinde anlamlı oranda azalmanın mevcut olduğu saptanmıştır (p<0.01 ve p<0.01). Kontrol grubu ile hasta grubuna ait preoperatif ve postoperatif enzim aktivite değerlerine ait değişim Şekil 4de gösterilmiştir.

Results

Discussion

Yapay kalp kapağı replasmanına ait komplikasyonlardan biri olan hemoliz günümüzde protez kapak yapı elemanlarının ve dizaynlarının gelişimine bağlı olarak önemli ölçüde azalmıştır. Başlangıç yıllarında replasman sonrası hemoliz görülme oranı %65-80 arasında, hemolitik anemiye ait klinik bulguların tespit edilme oranı ise %5-15 idi. Ayrıca cerrahi tekniklerin gelişmesi ile perivalvüler kaçakların ortadan kaldırılması, kapaklarda santral akım sağlanarak jet akımın ve türbülansın minimum düzeye indirilmesi de bu gelişmede önemli etkenler olmuşlardır [9-21] Jones ve ark. [1]aptıkları bir çalışmada bileaflet yapay kapak replasmanı uygulanan 94 hastanın hiçbirinde hemoliz görmediklerini belirtmişlerdir. Yine Akalın ve ark. [2] menteşe diskli kapak replasmanı sonrasında hemoliz hızının yılda %0.14 düzeyinde olduğunu göstermişlerdir.

Klinik düzeyde hemoliz görülme insidansı çok düşük oranlara indirilmiş olsa da yapay kapak nedeni ile eritrositlerin maruz kaldığı travma artışına bağlı bir miktar hemoliz her zaman mevcuttur. Bu hemolizin belirlenmesi ve derecelendirilmesinde serum haptoglobulin, serum LDH, idrar hemosiderin ve retikülosit sayısının önemli parametreler olduğu bildirilmiştir [23].

İntravasküler hemolizde direkt travmaya bağlı eritrosit parçalanmasının yanısıra eritrositli travmaya daha hassas kılan veya dayanıklılığını, esnekliğini azaltan etkenlerin de rol oynadığı yapılan biyokimyasal ve biyomoleküler çalışmalarla gösterilmiştir [24]. Mekanik hemoliz sonucu oluşan heminin eritrositlerde K+ kaybına, ozmotik frajilite artışına ve nihayet eritrositlerin şişerek parçalanmasına yol açtığı Chou ve Fitch tarafından gösterilmiştir [25]. Hemin aynı zamanda eritrosit zarı iskeletini ouşturan proteinlerin çözülmesine neden olarak eritrositlerin mekanik etkiye olan dayanıklılığını azaltmaktadır [26]. Hemin protein yapıda olan CA+2/mg+2 ATPaz enzim aktivitesini de inhibe etmektedir [27], ancak bu inhibitör etkinin hemolizi tam olarak açıklayabileceği konusunda görüş birliği yoktur.

Eritrosit zarındaki diğer taşıma enzimleri gibi ATPaz enziminin de aktivite gösterebilmesi için zar yapısındaki fosfolipidlerin varlığına gereksinim duyduğu bilinmektedir. Yapay kapağın eritrositlere uyguladığı hafif şiddette ama sürekli travma nedeni ile eritrosit zarından sürekli parçacıklar kopacak ve fosfolipid kaybı olacaktır. Bu durumda eritrosit zarı alanı azalacak ve buna bağlı olarak hücrez arında 200-400 arasında lokalizasyona sahip olduğu bilinen ATPaz miktarı da azalacaktır. Travmaya bağlı olarak eritrosit membran fosfolipidlerinde ve proteinlerinde denatürasyon meydana gelecek, bu da ATPaz aktivitesini olumsuz yönde etkileyecektir.

Diğer taraftan başta oubain olmak üzere kardiyak glikozidler, oligomisin, butadion ve vanadatın NA+-K+/mg ATPazı inhibe ettiği artık kesinlik kazanmıştır. Ayrıca hemidiyaliz, ekstrakorporeal dolaşım gibi eritrosi travması yaratan hallerde serbest O2 radikalleri oluşmasına bağlı lipid peroksidasyonu gelişmekte, bunun sonucunda ise eritrosit zarı sisteminde fonksiyon bozukluğu ve zar enzim sistemlerinde aktivite kaybı meydana gelmektedir [28-30].

Bu bilgiler ışığında çalışmanın bulguları gözden geçirildiğinde; hasta grubunda preoperatif devrede hemoliz parametreleri normal sınırlarda iken (hemoliz oluşmamışken) her üç ATPaz enzim aktivitesinin kontrol grubuna göre anlamlı ölçüde azaldığı görülmüştür (p<0.01). Bu durumda Na=K+/Mg+2 ATPaz aktivitesindeki azalma için hastaların preoperatif dönemde zaman zaman kardiyotonik glikozid kullanmış olmalarının etkili olduğu düşünülebilir. Fakat Mg+2, ATPaz ve Ca+2/Mg+2 ATPaz enzim aktivitelerinin azalma nedenlerini bununla açıklayamamaktayız.

Hasta grubunda postoperatif 4. ayda ATPaz enzim aktiviteleri preoperatif döneme göre anlamlı biçimde azalmış ve aynı dönemde hastalarda hafif hemoliz tespit edilmiştir. Bu devrede bu azalmaya yol açan etkenler arasında heminin ATPaz enzimine inhibitör etkisi akla gelmekteyse de, plazma haptoglobulin düzeyi tamamen yok olmadan hemin teşekkül edemeyeceği ve yine bu devredeki enzim aktivite azalmasının kardiyotonik glikozid kullanılmasına, mekanik travmaya bağlı fosfolipid tabakası bozulması ve bunun sonucu oluşan lipid peroksidasyonuna bağlı olduğu düşünülebilir.

Postoperatif 8. ayda da hasta grubu ATPaz enzim aktivitelerindeki azalma anlamlı bir şekilde sürmekte olduğu ve hafif hemoliz varlığı saptanıştır. Yani hemoliz şiddetinde değişme olmamış ancak enzim aktivitelerinde azalma devam etmiştir. Bu durum bize yapay kapak replasmanı yapılan hastalarda görülen ATPaz enzim aktivitesi azalmasının yalnızca hemolize bağlı olmadığını başka faktörlerin de bunda etkili olabileceğini düşündürmüştür.

Konunun iyice aydınlatılabilmesi için yapay kapak hastalarının devamlı kullandığı oral an-tikoagulanların (warfarin-Na) ve antiagregan-ların, lipid peroksidasyon ürünlerinin ve heminin detaylı incelendiği çalışmalar yapılması uygun olacaktır.

Discussion