This study was carried out in rats applied global cerebral ischemia, using four vessels occlusion method. The aim of the study was to investigate the effect of flavonoids to prevent the injury after reperfusion in ischemic tissue.
Materials and methods:
Three groups were constituted as the group 1 (control group), the group 2 (ischemia-reperfusion group) and the group 3 (ischemia-reperfusion after flavanoid treatment). In all the groups, malonyldialdehyde and glutathion peroxidase activity levels and histopathologically celluler structures were evaluated in cerebral tissues obtained after procedure.
RESULTS:
While malonyldialdehyde levels significantly increased in the group 2 compared to the controls, the increase ın the group 3 was not significant. GSH-Px activity levels were significantly increased in the group 2 (p<0.01). It was shown that the cells were histopathologically protected in the group 3.
Conclusion:
Our findings concluded that flavonoids were effective to diminish lipid peroxidation after reperfusion.
İskemi, reperfüzyon ve no-reflow fenomeni cerrahi sırasında doku hasarının potansiyel kaynaklarıdır [3]. Arkus aorta anevrizmalarının tamiri serebral dolaşımın geçici süre kesilmesini içeren girişimlerle mümkün olabilmektedir. Ancak, merkezi sinir sistemi anoxia'ya oldukça duyarlı olduğu için bu ameliyatlar sonrası oluşabilecek nörolojik hasar en korkulan komplikasyonlardır [4]. Bu esnada oluşan global serebral iskemiden beyini korumak amacıyla; hipotermik arrest, selektiv serebral perfüzyon ve retrograt serebral perfüzyon gibi stratejiler geliştirilmiştir [5, 6]. Ancak dolaşımın yeniden sağlanması da injuriyi artırabilmektedir. Hücre injurisine eşlik eden temel mekanizma serbest oksijen radikallerine bağlı lipid peroksidasyonudur ve bu olay poliansatüre yağ asitleri ile fosfolidlerden oluşan hücre membranını dekompose eder [7]. Serebral korumayı artırmak amacıyla E vitamini, C vitamini benzeri çeşitli farmakolojik ajanlar kullanılmaktadır [8].
Günümüzde kapiller duvar frajilitelerini azaltmak amacıyla kullanılan flavanoidlerin serbest radikallere bağlı hasarları azaltmada etkili olabildiklerine dair yayınlar mevcuttur [9]. Biz de deneysel global serebral iskemi-reperfüzyon modelinde oluşan hasarı ve bu hasarı önlemede flavanoidlerin etkisini biokimyasal ve histo-patolojik olarak araştırdık.
İskemi oluşturmak için Pulsinelli ve Brierly'nin dört damar okluzyon modeli kullanıldı [10,11]. Anestezi IM olarak 3 mg/kg xylazin (Rompun, Bayer) ve 40 mg/kg ketamin HCl (Ketalar, Eczacıbaşı) ile sağlandı. Hiçbir hayvana hemodinamik ve solunum desteği gerekmedi. Anestezi sonrası her iki common carotid arter ön midline servikal insizyonla explore edildi. Kalın ipek sütür materyali (2/0) karotis akımını kesmeyecek şekilde gevşekçe her bir arter etrafına dönülerek yerleştirildi ve sütürler insizyon hattından dışarı çıkarıldı. Sonra tek bir sütür ile insizyon kapatıldı. İkinci bir insizyon boyun dorsaline orta hattına yapıldı ve her iki vertebral arter bipolar elektrokoter ile birinci servikal vertebranın alar foramenı boyunca koterize edildi. Daha sonra hayvanların uyanması için bir gün beklenildi. Hayvanlar uyandıktan sonra 30 dk süreyle karotid akım kesilecek şekilde ipekler sıkıştırıldı. Vücut ısısı işlem sırasında ve işlemden sonraki 30 dk süreyle 37 0C de sabit tutuldu. 30 dakika sonra karotis etrafındaki ipekler gevşetildi ve karotis akımının restore olduğu direkt olarak gözlendi. Grup 2 ve 3'deki hayvanlarda 20 dk süreyle reperfüzyon uygulandı. İntraperitoneal olarak 0.05 ml/ 100 gr olacak şekilde verilen yüksek doz Nembutal ile sacrifie edildi. Bu işlem sonrası kafatası açılarak tüm beyin ve beyincik dokuları çıkarıldı. Çıkarılan dokular iki eşit parçaya bölünerek yarısı biyokimyasal analiz yarısı histopatolojik inceleme için alındı. Biyokimyasal analiz için dokular serum fizyolojikle yıkanıp alimunyum folyaya sarılarak -80ºC derin dondurucuya yerleştirildi.
Biyokimyasal İnceleme:
Beyin dokusu MDA düzeyleri Ohkawa ve ark. [12] nın geliştirdiği yöntemle ölçüldü. Beyin dokusunun 1 gramına 9 ml %1.15 KCl eklendi (1:10) ve teflon uç yardımıyla ultra-tunnax T25 Homogenizer ile homojenize edildi. Daha sonra 0.2 ml %10 (w/v) doku homojenatı, 0.2 ml %8.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 1.5 ml %20 asetik asid solusyonu ilave edilip 1.5 ml %0.8 aköz tiyobarbitürik asit solusyonundan katılarak, son hacim 4 ml olacak şekilde distile su ile tamamlandı. 60 dakika 95ºC sıcak kaynar su banyosunda inkubasyondan sonra çeşme suyu ile soğutularak, 1 ml distile su ve 5 ml n-butanol-piridine karışımından (15:1 v/v) eklendi ve santrifüj edilerek üstteki organik tabaka alındı ve 532 nm dalga boyunda absorbans ölçümü yapılarak MDA düzeyleri hesaplandı.
Beyin dokusunda GSH-Px aktivitesi NADPH'ın glutatyon reduktaz enzimi ile oksidasyonu esasına dayalı olarak çalışan Paglia ve arkadaşları [13]'nın metoduna göre ölçüldü. Beyin doku örnekleri %0.9 NaCl ile yıkandıktan sonra 0.05 M fosfat tamponu (pH:7) ile 10 kat sulandırılarak teflon uçlu ultra-Tunnax T25 Homogenizer ile 4 dakika aerobik şartlarda homojenize edildi. Daha sonra 15 000 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek elde edilen supernatantlarda GSH-Px aktivite tayinlerde yapıldı. Doku protein düzeyleri ise Lowry metodu ile ölçüldü [14].
Histolojik inceleme:
Histolojik inceleme için hipokampus ve cerebellumdan alınan doku örnekleri % 10'luk formolde tespit edilerek rutin takip işleminden sonra parafine gömüldü. Parafin bloklardan 4 mikrometre kalınlığında elde edilen kesitler hematoksilen eozin ile boyanarak ışık mikroskobunda (Olympus BX 50, Japan) değerlendirildi. Hipokampus bölgesindeki pramidal hücreler ile cerebellumdaki purkinje hücreleri yapısal yönden değerlendirildi.
İstatistik:
Elde edilen veriler ortalama ± standart deviasyon olarak alındı. İstatistiksel analiz için grup içi ve gruplar arası varyans analizi için paired t testi (Mann Withney U) uygulandı. P<0.05 anlamlı olarak kabul edildi.
