ISSN : 1301-5680
e-ISSN : 2149-8156
Turkish Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery     
Kalıcı fibrilasyon sürecindeki insan sağ atriyal miyositlerinde apoptotik protein ekspresyonları
Günseli Çubukçuoğlu Deniz1, Serkan Durdu2, Ahmet Rüçhan Akar2, Nalan Akyürek3, Ömer Akyürek4, Çağın Zaim2, Ümit Özyurda2
1Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü, Ankara
2Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı, Ankara
3Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı, Ankara
4Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Kardiyoloji Anabilim Dalı, Ankara

Abstract

Background: The aim of this study was to investigate the role of apoptosis in the pathogenesis of atrial fibrillation (AF).

Methods: Thirty consecutive patients submitted for mitral valve surgery were investigated. Eleven patients with permanent AF (6 males, 5 females; mean age 57.7±13.1 years; range 36 to 76 years) were considered as the AF group whereas 19 patients who were in sinus rhythm (11 males, 8 females; mean age 64.1±8.4 years; range 48 to 77 years) were selected as control subjects. Mean left atrial diameter determined by echocardiography was 54.8±3.4 mm in the AF group compared to 40.7±4.1 mm in controls (p=0.001). The right atrial appendage tissue samples were excised before extracorporeal circulation in all patients. We assessed the onset of in situ DNA fragmentation by using the TUNEL assay. Furthermore, we examined the expression pattern of anti-apoptotic Bcl-2 and pro-apoptotic Bax proteins using immunohistochemistry.

Results: Bax and Bcl-2 expression were similar between the AF group and control subjects (16.2% versus 15.1%, p=0.73; 14.6% versus 16.1%, p=0.64, respectively). However, when compared with controls, atrial myocyte apoptosis was significantly higher within the AF group (mean apoptotic index, 21.9% versus 11.8% respectively, p=0.002). Atrial tissue from permanent AF-affected individuals had atrial myocyte nuclei that were positive for TUNEL whereas control subjects had either TUNEL negative or low-grade TUNEL positivity.

Conclusion: This pilot study demonstrated a positive correlation between AF and DNA fragmentation, a terminal determinant of apoptosis. The results suggest a potential link between the pathogenesis of permanent AF and atrial myocyte apoptosis. Targeted anti-apoptotic strategies may have a clinical value by preventing atrial remodeling and fibrosis.

Atriyal fibrilasyon (AF), mitral kapak hastalığı olgularında %60-80 oranında görülen, kapak ameliyatları sonrasında hastaların uzun dönemde yaşam süresini ve yaşam kalitesini olumsuz yönde etkileyen bir ritim bozukluğudur.[1,2] Primer kalp hastalığı ortadan kaldırılsa bile ritim bozukluğu çoğunlukla devam edebilmektedir. Son zamanlarda kullanımı giderek artan, mitral kapak cerrahisiyle eş zamanlı uygulanan radyofrekans ablasyon işlemlerinde bile kalıcı sinüs ritminin restorasyonu %76’lar düzeyinde kalmaktadır.[3] Atriyal fibrilasyona neden olduğu düşünülen veya AF sürecinde meydana gelen hücresel değişimlerden biri de atriyal miyositlerin programlı hücre ölümüdür.

Apoptozis; inflamatuvar bir yanıtı tetiklemeden hücre ölümünü kontrol eden bir sinyal kaskadının aktifleştiği, çok iyi regüle edilen ve evrimsel olarak korunmuş, enerji bağımlı bir “hücre intiharı” programıdır.[4] Bu program, normal doku gelişimi sırasında ihtiyaç duyulmayan yapıların uzaklaştırılması ve dokunun şeklini alabilmesi için çalışır. Ayrıca yetişkin organizmalarda, hücresel hasarlara yanıt olarak, hasar görmüş hücrelerin çevre dokuya zarar verilmeden uzaklaştırılması için de aktive olur. Son zamanlarda yapılan çalışmalarla çeşitli kalp ritim bozuklukları ile apoptozis ilişkilendirilmiştir.[5-9] Bu çalışmaların sonuçlarından da anlaşılacağı gibi fokal sessiz bir apoptotik odak, tıpkı nekrotik hücreler gibi ileti sistemini etkileyerek aritmi veya bloklara yol açabilmektedir.

Çalışmamızın amacı, AF patogenezinde apoptozisin rolü olup olmadığını araştırmaktır. Bu amaçla mitral kapak hastalığı nedeniyle cerrahi tedavi endikasyonu bulunan, kalıcı AF hastaları ile normal sinüs ritimli hastalardan alınan sağ atriyal doku örneklerinde, apoptozisin terminal belirteci olan DNA (Deoksiribonükleik asit) fragmantasyonu ve programlı hücre ölümünün mitokondriyal yolağını regüle eden pro- ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinleri karşılaştırılmıştır.

Methods

Hasta Kohortu
Hastaların çalışmaya dahil edilme kriterleri; ciddi mitral kapak patolojileri nedeniyle kalp cerrahisine alınan hastalarda kalıcı AF veya normal sinüs ritmi olarak belirlendi. Çalışmadan dışlanma kriterleri ise; (i) kontrol grubu için daha önceden geçirilmiş paroksismal AF ya da atriyal flutter öyküsü, (ii) ikinci ya da üçüncü derece kalp bloğu varlığı, (iii) kronik böbrek yetmezliği, (iv) sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunun (SVEF) %30’un altında olması, (v) dilate kardiyomiyopati, (vi) otoimmün hastalık, (vii) Hepatit B virüs (HBV) ve Hepatit C virüs (HCV) infeksiyonu, geçirilmiş tüberküloz infeksiyonu, (viii) inflamatuvar yanıta neden olan vaskülit, miyokardit, infektif endokardit gibi patolojiler, (ix) geçirilmiş ya da mevcut malignite öyküsü, (x) Wolff-Parkinson-White, Brugada sendromu gibi genetik orijinli hastalıklar ve (xi) hastanın yazılı onam vermemesi olarak belirlendi. Çalışma, Ankara Üniversitesi Etik Kurulu’ndan alınan izin sonrası başlatıldı. Çalışmaya katılan tüm hastalardan ameliyat ve örnekleme öncesinde bilgilendirilmiş onam formu alındı (Şekil 1).

Şekil 1: Çalışmanın akış diyagramı. DNA: Deoksiribonükleik asit; AF: Atriyal fibrilasyon; NSR: Normal sinüs ritmi.

2 Ocak 2008 - 15 Eylül 2008 tarihleri arasında ameliyata alınan 30 hasta çalışmaya dahil edildi. Kalıcı AF’si olan 11 hasta (6 erkek, 5 kadın; ort. yaş 57.7±13.1 yıl; dağılım 36-76 yıl) çalışma grubunu oluştururken, normal sinüs ritmindeki 19 hasta (11 erkek, 8 kadın; ort. yaş 64.1±8.4 yıl; dağılım 48-77 yıl) kontrol grubunu oluşturdu (p=0.116). Atriyal fibrilasyon grubundaki hastaların ortalama sol atriyum çapı 54.8±3.4 mm iken kontrol grubundaki sinüs ritimli hastaların ortalama sol atriyum çapı 40.7±4.1 mm olarak ölçüldü (p=0.001). Hastaların ameliyat öncesi demografik verileri Tablo 1’de hemodinamik özellikleri Tablo 2’de sunulmuştur.

Tablo 1: Ameliyat öncesi demografik özellikler

Tablo 2: Ameliyat öncesi hemodinamik özellikler

Ameliyat detayları
Ameliyata alınacak hastalara, ameliyat öncesi premedikasyon amacıyla Midazolam (Dormicum® 5 mg/5 ml ampul, Roche, Türkiye) 2 mg i.v, Sefazolin sodyum (Cefamezin® 1000 mg Flakon, Fujisawa-Eczacıbaşı, Türkiye) i.v uygulandı. Genel anestezi amacıyla 5 mg Midazolam i.v, 20 mg Etomidat i.v (20 mg), 500 mcg Fentanyl i.v (Fentanyl®, Janssen-Cilag, Türkiye), %1-1.5 İsofluran inhaler ve 4 lt/dk 02 kullanıldı. Kardiyopulmoner bypass (KPB)’a girilmeden önce kontrol ve çalışma grubundaki tüm hastalarda sağ atriyuma 4/0 polypropilen sütür ile purse-string sütür konulduktan sonra, örnek alınacak dokuyu travmatize etmemek amacıyla minimum manipülasyonla yaklaşık 1.5x1.5x0.5 cm3 boyutlarındaki sağ atriyum dokusu eksize edildi. Daha sonrasında eksize edilen sağ atriyum dokusu zaman kaybedilmeden immünohistokimyasal inceleme için uygun transport solüsyonuna (%10 formaldehit) aktarıldı. Hastaların demografik, ekokardiyografik, cerrahi patoloji ve cerrahi teknikler ve takiple ilgili tüm verileri, Bilkent Üniversitesi ile birlikte ortak olarak oluşturulan web tabanlı TurkoScore veri tabanına aktarıldı.

İn situ DNA fragmantasyon analizi (TUNEL)
Kardiyak dokularda in situ DNA fragmantasyonu, TdT-(terminal deoksinükleotidil transferaz) aracılı floresan-dUTP işaretleme (TUNEL) yöntemiyle belirlendi.[ 10] TUNEL, üreticinin talimatlarına göre ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis detection kit (S7110, Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA) kullanılarak uygulandı. Apoptotik hücrelerin görüntülenmesi için peroksidaz substrat 3.3-diaminobenzidin kullanıldı. Nükleer boyama için methyl green (%0.5) kullanıldı. TUNEL-pozitif hücreler ışık mikroskobu (Olympus, Bx51, Japan) altında görüntülendi. TUNELpozitif hücreler sayıldıktan sonra her kardiyak dokudaki apoptotik hücrelerin oranı, toplam kas hücre çekirdek sayısına göre hesaplandı.

İmmünohistokimya
Sağ atriyal dokulardan alınan örnekler %10 formaldehitte fikse edildikten sonra parafine gömüldü. Parafin bloklardan alınan 4 mikron kalınlığındaki kesitler 56 °C’lik etüvde deparafinize edildi. Endojen peroksidazı bloke etmek için %3’lük hidrojen peroksitte 10 dk süre ile bekletildi. Fosfat buffer solüsyonu ile yıkandıktan sonra 0.01 M sodyum sitrat buffer (pH 6.0) içinde toplam 20 dk süre ile mikrodalga fırında işlemden geçirildi. İmmünohistokimyasal boyama streptavidinbiyotin peroksidaz yöntemi kullanılarak yapılr. Kesitler Bcl-2 (klon bcl2/100/D5, kullanıma hazır, NeoMarkers, USA) ve Bax (klon 2D2, NeoMarkers, USA) ile oda sıcaklığında iki saat süre ile inkübe edildi. Renk vererek görüntülemeyi sağlamak amacıyla 3-amino-9- etilkarbazol (AEC, LabVision, NeoMarkers) ile 10 dk süre ile inkübe edildi. Kesitler Mayers hematoksilen ile zemin boyaması yapılarak kapatıldı. Ayrıca primer antikorun uygulanmadığı negatif kontrol boyama yapıldı.[10] İmmünohistokimyasal incelemeler gruplara iki gözlemci tarafından miyositlerin yoğun olarak izlendiği rastgele beş mikroskobik alan taranarak yapıldı. Pozitif doku kontrolü olarak tonsil kullanıldı. Bcl-2 ve Bax ile %10’dan fazla sitoplazmik boyanma gösteren miyositler pozitif olarak kabul edildi.

İstatistiksel analiz
Değerlendirmeler SPSS 16.0 versiyon istatistik programı (SPSS Inc; Chicago, Illinois, USA) kullanılarak yapıldı. Sayısal değişkenler median (interquartile range: IQR) olarak ifade edildi ve Mann-Whitney U-testi ile karşılaştırıldı. Kategorik değişkenler gruptaki hasta sayısı ve yüzde değeri olarak ifade edildi. Kategorik değişkenlerden hiperlipidemi ve aspirin kullanımı açısından gruplar arasında farklılık olup olmadığı “Pearson Ki-kare testi” ile, diğer kategorik değişkenlerin sıklığı arasındaki farklılık ise “Fisher’s exact test” ile değerlendirildi, p<0.05 değeri anlamlı kabul edildi.

Results

Atriyal fibrilasyon grubunda bulunan hastaların altısına mekanik bileaflet protezin kullanıldığı mitral kapak replasmanı, triküspid ring annuloplasti ve bu hastaların dördüne irrigasyonlu monopolar kateter aracılığıyla radyofrekans ablasyon (RFA) işlemi yapıldı. Radyofrekans ablasyon uygulanan hastalar, ameliyat sırası süreçte başlanan amiodaron (900 mg/24 saat) infüzyonu aldı. Bu hastaların tamamı sinüs ritmi ile taburcu edilmiş idi. Sol ventrikül çıkım yolu gradienti olan (peak gradient 140 mmHg) bir hastaya tekrar ameliyatla mekanik kapak kullanılarak mitral ve aort kapak replasmanı yapıldı. Bu hastada KPB’den ayrılma döneminde gelişen A-V tam blok nedeniyle A-V sequential pacemaker gereksinimi oldu. Ameliyat sonrası 10 günlük bekleme süresi sonrasında A-V tam bloğu düzelmeyen hastaya kalıcı pil implantasyonu yapıldı. Yine AF grubundaki üç hastaya koroner bypass ile eş zamanlı mitral kapak onarım işlemi (ring annuloplasti) uygulandı. Atriyal fibrilasyon grubundaki hastaların hiçbirinde hastane mortalitesi olmadı.

Çalışmamızda kalıcı AF’li hastaların sağ atriyal doku örneklerinde apoptozis araştırmasında kontrol grubuyla yapılan karşılaştırmada, istatistiksel olarak anlamlı düzeyde DNA kırıkları TUNEL yöntemi ile gösterildi. Hastaların ameliyat öncesi karakteristikleri açısından değerlendirilmesinde iki grup arasında AF ve sol atriyum çaplarından (sol atriyum çapı çalışma grubunda 54.8±3.4; kontrol grubunda 40.7±4.1, p=0.001) başka farklılık tanımlanmadı. Kontrol ve çalışma grubundaki hastaların olası apoptotik sonuçlar üzerinde etkili olan özellikleri Tablo 3’de özetlenmiştir.

Tablo 3: Hastaların klinik ve apoptotik süreçle ilgili verileri

Bcl-2 Protein ifadesi
Apoptozis oluşumunu önleyici etkisi olan antiapoptotik Bcl-2 protein ifadesinin kontrol grubunda ekspresyon oranı %16.1 iken AF grubunda %14.6 oranındadır (p=0.64). Bcl-2 ekspresyonu iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıkta değildir. Bu farksızlık pro-apoptotik Bax ekspresyonu ile anti-apoptotik Bcl-2 ekspresyonu arasındaki matematiksel olmayan denge ile ilişkilendirildi. Atriyal fibrilasyon grubundaki Bcl-2 ekspresyonu Şekil 2a’da, kontrol grubundaki Bcl-2 ekspresyonu Şekil 2b’de gösterilmiştir.

Şekil 2: Atriyal fibrilasyon ve kontrol grubuna ait immünohistokimya ve TUNEL görüntüleri. (a) Atriyal fibrilasyonlu bir hastanın sağ atriyal kardiyomiyositlerinde sitoplazmik Bcl-2 ekspresyonu (AEC x 400). (b) Normal sinüs ritimli bir hastanın sağ atriyal kardiyomiyositlerinde yaygın sitoplazmik Bcl-2 ekspresyonu (AEC x 400). (c) Atriyal fibrilasyon grubu örneğinde sağ atriyal kardiyomiyositlerde yaygın sitoplazmik pro-apoptotik Bax protein ekspresyonu (AEC x 400). (d) Normal sinüs ritimli olgunun sağ atriyal kardiyomiyositlerinde AF olgusuna göre daha az yoğunlukta pro-apoptotik Bax protein ekspresyonu (AEC x 400). (e) Sağ atriyal dokuda TUNEL pozitif apoptotik hücreler (TUNEL x 400). (f) Miyositlerde apoptotik nükleer boyanma izlenmemektedir (TUNEL x 400). (g) Atriyal fibrilasyonlu olguda, sağ atriyal kardiyomiyositlerde miyokardiyal yapı bozulmuş olup, normal olmayan çekirdekler içeren ve nükleer büyüme gösteren miyositler izleniyor (H-E x 400). (h) Sağ atriyal kardiyomiyositlerde kalp kasında nükleer büyüme gösteren miyositler izleniyor (H-E x 400).

Bax protein ifadesi
Pro-apoptotik Bax protein ekspresyonunun AF grubunda %16.2 oranında olduğu tespit edilirken kontrol grubunda %15.1 oranında olduğu belirlendi (p=0.73). Atriyal fibrilasyon grubundaki Bax ekspresyonu Şekil 2c’de, kontrol grubundaki Bax ekspresyonu Şekil 2d’de gösterilmiştir.

İn situ DNA fragmantasyon analizi (TUNEL) bulguları
Deoksiribonükleik asit kırıklarının saptanması bir hücrenin apoptozise gittiğinin önemli bir biyokimyasal kanıtı olduğundan hem normal sinüs ritimli, hem de AF’li hastalardan alınan doku kesitlerinde DNA kırıklarının varlığı TUNEL yöntemi ile araştırıldı. Bu araştırma sonucunda; AF’li hastalardan alınan kesitlerde TUNEL pozitif hücrelerin %21.9 oranında olduğu, kontrol grubunda ise bu oranın %11.8 olduğu hesaplandı (p=0.002). Atriyal fibrilasyonlu hastalar belirgin şekilde uniform olarak apoptozisin terminal belirteci olan TUNEL pozitifliği gösterirken, kontrol grubundaki hastaların büyük çoğunluğu (n=11) TUNEL negatif, geri kalanlar düşük yoğunlukta TUNEL pozitifliği paterni sergiledi. Atriyal fibrilasyon grubu örneğinde TUNEL pozitifliği Şekil 2e’de izlenirken kontrol grubundaki kesitte TUNEL reaksiyonunun olmadığı Şekil 2f’de izlenmektedir. TUNEL pozitifliğinin sadece bazı hücrelerde olması ve hücrelerin çekirdeği ile aynı yerde görülmesi (Şekil 2e), elde edilen sonucun özgünlüğünü göstermektedir. Çalışma ve kontrol grubunda tespit edilen TUNEL oranları Şekil 3’te ifade edilmiştir.

Şekil 3: Atriyal fibrilasyon ve kontrol gruplarının apoptotik belirteçler açısından karşılaştırılması. AF: Atriyal fibrilasyon.

Discussion

Apoptozisin araştırıldığı bu çalışmada, kalıcı AF’li hastaların sağ atriyal doku örneklerinde, kontrol grubuyla yapılan karşılaştırmada istatistiksel olarak anlamlı düzeyde DNA kırıkları TUNEL yöntemi ile gösterilmiştir. Bu çalışmada, kalıcı AF’si olan hastaların sağ atriyal doku kesitlerinde normal sinüs ritimli hasta kesitlerine göre, immünohistokimyasal yöntemlerle pro-apoptotik Bax protein ekspresyonun artma eğiliminde ve antiapoptotik Bcl-2 protein ekspresyonunun azalma eğiliminde olduğu gösterildi. Ancak bu artma/azalma eğilimleri arasında istatistiksel farklılık tespit edilemedi.

Atriyal fibrilasyon, sıklıkla paroksismal formundan daha inatçı ve kalıcı formuna progresif olarak ilerler. Wijffels ve ark.[11] keçi modeli aracılığıyla yaptıkları araştırmanın sonucunda “Atriyal fibrilasyon, atriyal fibrilasyonu doğurur” tezini ortaya atmışlardır. Hastalığın zamanla oluşan bu değerlendirmesi, yapısal kalp hastalığının progresyonunun, AF’nin devamına izin vermesine bağlı olarak meydana gelen atriyal yeniden biçimlenmeyle (remodeling) açıklanabilir. Elektriksel, yapısal ve kontraktil olmak üzere üç çeşit atriyal yeniden biçimlenme olduğu öne sürülmüştür.[12] Atriyal fibrilasyon ile oluşan atriyal yeniden biçimlenme sırasında, farklı zaman dilimlerinde farklı moleküler patolojik değişiklikler ortaya çıkmaktadır. Bu zaman dilimlerinden saniyelerle dakikalar arasında olan ‘kısa dönemde; iyon konsantrasyonu, pompa aktivitesi ve fosforilasyon gibi metabolik değişimler görülmektedir. Saatlerle günler arasında gerçekleşen ‘orta dönem’, gen ekspresyon değişimleri ve kalsiyum down regülasyonu ile karakterizedir. Haftalardan aylara kadar süren ‘uzun dönemin etkileri de-diferansiyasyon ve miyolizis gibi hücresel değişimleri içerir. Son olarak da kalıcı AF’nin dahil olduğu ‘çok uzun dönem’ aylardan yıllara kadar sürer; fibrozis, yağ dejenerasyonu ve hücre ölümü gibi histolojik değişimlerin olduğu geri dönüşümsüz doku hasarı gözlenir.[11-13] Deneysel izole AF çalışmalarında, fibrilasyonun indüklenmesi sonucunda hücresel volüm artışı, miyolizis, glikojen birikimi, mitokondriyal değişiklik ve kromatin redistribüsyonunu içeren atriyal de-diferansiyasyon bulguları tespit edilmiştir.[14] Ayrıca yapılan son çalışmalarda atriyal dokuda fibrozisin bulgusu olarak kabul edilen belirteçlerin ameliyat sonrası AF eğilimini artırdığına dair bulgular saptanmıştır.[15] Bir başka ifadeyle atriyal fibrozisin AF eğilimine neden olduğu tespit edilmiştir. Bu bilgilerden hareketle apoptozisi araştırdığımız çalışma grubunu kalıcı AF’li hastalardan oluşturduk.

Apoptozis, regüle edilebileceği değişik basamakları olan çok adımlı bir hücre ölümü prosesidir. Özellikle Bcl-2 gen ailesi tarafından pro- veya anti-apoptotik protein ekspresyonlarının çeşitli nedenlerle artması/ azalmasına göre apoptozis regüle edilir.[16] Bu durum, tam diferansiye olmuş kardiyomiyositlerin geri dönüşümsüz hücre hasarına yanıt olarak, miyokardiyuma daha çok zarar veren nekrozisin yerine apoptozise yönlendirilebilmesi veya kurtarılabilir hücrelerin gereksiz ölümünün engellenmesi açısından önemli bir özelliktir. Apoptozisin uyarımı veya inhibisyonu; kanser, nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklar gibi çeşitli hücresel hasarların olduğu patolojilerin önlenmesi ve tedavisi için yeni ve önemli bir hedef olacaktır.

Kardiyovasküler sistemin normal embriyonik gelişimi sırasında apoptozis yoğun olarak meydana gelirken erişkinlerde apoptozis mekanizmaları, kalpte inaktif halde bulunur.[1,2] Bunun yanında çeşitli kardiyak ve vasküler hastalıklarda apoptozis mekanizmalarında değişiklikler olduğu gösterilmiştir. Tip-A aort diseksiyonlu hastaların vasküler düz kas hücrelerinde proapoptotik Bak proteini ekspresyonunun ve DNA fragmantasyonunun kontrol örneklerine oranla fazla olduğu çalışma grubumuz tarafınca gösterilmiştir.[17] Afrika’da familyal olarak rastlanan progresif kalp bloğunda, Brink Sendromu’nda, Brugada Sendromu’nda ve uzun QT sendromunda sinüs düğümü ve atriyoventriküler düğümde selektif apoptozise bağlı destrüksiyon olduğu gösterilmiştir.[5-9] Öte yandan kardiyovasküler hastalıklarda AF ile apoptozis arasındaki ilişki irdelenmiştir. Ak ve ark.ları[18] koroner bypass ameliyatına alınan hastalarda sağ atriyal dokudaki apoptozisin ameliyat sonrası AF gelişiminde bağımsız bir risk faktörü olduğunu göstermişlerdir. İnsan kalp dokusunda yapılan araştırmalar sonucunda apoptozisin, idiyopatik dilate kardiyomiyopati, iskemik kardiyomiyopati, aritmojenik sağ ventrikül displazisi ve hipertrofik kardiyomiyopati gibi durumlarla ilişkisi olduğu saptanmıştır.[19,20] Bu gibi hastalıklarda apoptozis düşük yoğunlukta gerçekleşmesine rağmen, kalp yetmezliğinin son dönemlerinde genel olarak kardiyomiyosit kaybının apoptozisle gerçekleştiği düşünülmektedir. Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada, kalp yetmezliğinin düzeyi ile pro-apoptotik Bax seviyesi arasında bir ilişki olduğu gösterilmiştir.[21] Elimizdeki bulgular apoptozisin kalp yetersizliğinde etyolojik bir neden mi yoksa sonuç mu olduğunu tam aydınlatamamaktadır. Ancak, etyolojisi ne olursa olsun tüm kalp yetersizliklerinde apoptozis süreci tetiklenmiştir.[22] Çalışmamızda kalp yetmezliği belirteci olarak kullanılabilecek sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonları (çalışma grubu; 51.1±10.4, kontrol grubu; 52.1±10.1, p=0.79) açısından farklılık izlenmedi. Öte yandan hastaların NYHA fonksiyonel kapasiteleri (çalışma grubu; 2.5±0.5, kontrol grubu; 3.2±0.4, p=0.49), sol ventrikül diyastol sonu çapları (çalışma grubu; 51.1±8.4, kontrol grubu; 49.1±8.6, p=0.53) ve sol ventrikül sistol sonu çapları (çalışma grubu; 32.8±7.6, kontrol grubu; 32.6±9.7, p=0.96) arasında istatistiksel farklılık kaydedilmedi. Bir başka ifadeyle apoptotik son noktada, elde edilen sonuçları etkileme potansiyeli olan kalp yetmezliği faktörü açısından gruplar arasında farklılık yoktur.

Apoptotik sürece müdahale etmeyi amaçlayan farmakolojik çalışmaların, özellikle kalp yetmezliği ve apoptozis arasındaki ilişkiyi irdelediği gözlenmektedir. Bu çalışmalarda en çok, kalp yetersizliğinde progresif sol ventrikül disfonksiyonunun devam eden kardiyomiyosit kaybına bağlı olduğu hipotezi üzerinde durulmaktadır. Deneysel olarak hipoksi, renin-anjiyotensin sisteminin aktivatörleri (Anjiyotensin-II), serbest oksijen radikalleri, hücrede artmış kalsiyum yükü ve norepinefrinin miyositlerde apoptozisi tetiklediği gösterilmiştir.[22] Buna göre Anjiyotensin-II blokerleri ya da ACE (Anjiotensin converting enzyme) inhibitörü kullanımının apoptozis çalışmalarında gruplar arasında farklı düzeyde olması, elde edilecek sonuçları etkileme potansiyelindedir. Bu bakış açısından hareketle, çalışma ve kontrol grubu arasında ACE/Anjiyotensin-II blokeri kullanımı açısından farklılık kaydedilmedi (çalışma grubunda 8 hasta, kontrol grubunda 10 hasta, p=0.442). Öte yandan beta-blokerlerin de iskemiyi takiben reperfüzyon öncesinde uygulandıklarında apoptozisi azalttıkları gösterilmiştir.[20] Beta-bloker, alfa-1 bloker ve antioksidan etkileri olan karvedilol apoptozisi %77 oranında azaltırken non-selektif beta bloker olan propranololde bu oran %39 olarak saptanmıştır.[20] Bu durumda betabloker kullanımının da elde edilen sonuçları etkileme potansiyeli vardır. Çalışmamızda hastaların beta-bloker kullanımı açısından da gruplar arasında farklılık olmadığı tespit edildi (çalışma grubunda yedi hasta, kontrol grubunda 14 hasta, p=0.69).

Hücre fizyolojisi ve patolojisindeki temel rolü son yıllarda ortaya çıkan apoptozisin moleküler düzeyde anlaşılması tedavi yaklaşımlarına yeni boyutlar getirecektir. Apoptozisin uyarımı ve inhibisyonu, belirli kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde ve önlenmesinde ideal bir yöntem gibi görülmektedir. Ancak klinikte apoptozisten yararlanabilmek için selektif dokularda bu sürecin nasıl başlatılabileceği ve nasıl sonlandırılabileceğine yönelik yoğun çalışmalara gereksinim vardır. Çalışmadan elde ettiğimiz sonuçlarla AF patogenezinde apoptozisin rolü olduğu düşünülebilir. Bu bilginin üzerinde yapılacak ileri çalışmalar ile sonuçları açısından önemli olan bu ritim bozukluğunun tedavisinde yeni bakış açıları geliştirme potansiyeli gündeme gelebilecektir. Çalışma grubumuzun atriyal fibrilasyonun moleküler temellerini araştırmaya yönelik, hasta ile kontrol gruplarının daha iyi homojenize edildiği ve yüksek işlem hacimli moleküler tekniklerin kullanıldığı araştırmaları devam etmektedir. Devam eden ileri araştırmalarımız, 108S375 proje numarasıyla TÜBİTAK tarafından desteklenmektedir.

Çalışmanın sınırlamaları
İlerleyen bilimsel süreç içerisinde hastalıkların patogenezlerinin tanımlanmasında moleküler mekanizmalar ve ultra strüktürel araştırmalar önem kazanmaktadır. Bu çalışmada AF ile apoptozis arasındaki ilişki irdelendi. Çalışmamızda, AF’li olgularda, sağ atriyal kardiyomiyositlerde pro-apoptotik protein ifadelerinde artış eğilimi ve apoptozisin terminal belirteci olan DNA fragmantasyonunda istatistiksel olarak anlamlı artış tespit edildi. Ancak bu çalışma ile apoptozisin AF’ye yol açtığı sonucuna ulaşılamamaktadır. Atriyal fibrilasyonda ortaya çıkan kronik basınç ve volüm yükünün, sağ atriyal dokuda apoptotik süreci harekete geçirmesi olasılığı vardır. Bir başka ifadeyle bu çalışma AF’li hastaların sağ atriyal dokularında apoptozisin varlığını göstermekle beraber, apoptozis fenomeninin AF’nin altında yatan etyolojik nedenlerle mi yoksa AF sürecinden sonra mı geliştiğinin yanıtını verememektedir. Bu soruya yanıt bulabilmek amacıyla deneysel hayvan modellerine gereksinim vardır. Çalışmanın bir diğer kısıtlaması, doku örneklerinin sağ atriyal dokudan alınmasıdır. Atriyal fibrilasyon, birincil olarak sol atriyumu etkileyen ritim sorunudur. Ancak ilerleyen süreç içerisinde artan volüm ve basınç yükü nedeniyle sağ atriyum da patolojik sürece katılmaktadır. Sol atriyal doku örneklemesi ve özellikle posteriyor sol atriyal duvardan alınacak biyopsiler ile elde edilecek verilerin ideal olduğu yadsınamaz. Ancak, çalışmamızda sol atriyal örneklemeler sadece sol atriyal orijinli tromboembolizmi önlemek amacıyla sol atriyal apendajın bağlanma endikasyonu olan hastalarda gerçekleştirildi. Sol atriyal biyopsileri tüm çalışma grubunda gerçekleştirmek etik nedenlerle mümkün olamamıştır. Sol atriyal örnekleme, KPB sırasında düşük de olsa hava embolisi ve/veya sol atriyal apendajda yerleşmiş trombüsün yerinden oynatılarak tromboemboli riskini artırmaktadır. Bu nedenlerle teknik olarak sol atriyal örneklemeler ancak KPB’ye girildikten sonra alınabilmektedir. Kardiyopulmoner bypass’a girildikten sonra alınan sol atriyal doku örneklerinde de, KPB’ye bağlı olarak ortaya çıkan inflamatuvar yanıtın AF üzerine etkileri nedeniyle apoptozise ait bulguları gölgeleme ihtimali vardır. Bu nedenle sol atriyal örnekler üzerinden apoptotik süreç değerlendirilmedi. Sonuç olarak, hastalar arasındaki eşitliği bozmamak amacıyla, apoptozis araştırması tüm hastalarda sağ atriyal doku örneklerinde çalışıldı. Sağ atriyal basınç yükünün indirekt belirteci olan pulmoner arter basıncı açısından çalışma ve kontrol grupları arasında fark bulunmadığı görüldü. Bu nedenle apoptozis son noktası açısından sağ atriyal doku örneklemesi elde edilen sonuçları etkilememektedir.

Teşekkür
Araştırma, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü ve Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi araştırma fonlarından sağlanan bütçeler ile gerçekleştirilmiştir. Araştırma grubu olarak, apoptozis konusundaki bilimsel yorum ve yönlendirileri nedeniyle Doç. Dr. K. Can Akçalı’ya ve Doç. Dr. Hilal Özdağ’a, çalışmanın istatistiki değerlendirme ve yorumlarından dolayı Prof. Dr. Mustafa Kılıçkap’a, doku örneklerinin toplanmasındaki yardımlarından dolayı Kalp ve Damar Cerrahisi ameliyathane hemşirelerine teşekkürlerimizi sunarız.

References

1) Feinberg WM, Blackshear JL, Laupacis A, Kronmal R, Hart RG. Prevalence, age distribution, and gender of patients with atrial fibrillation. Analysis and implications. Arch Intern Med 1995;155:469-73.

2) Wolf PA, Abbott RD, Kannel WB. Atrial fibrillation as an independent risk factor for stroke: the Framingham Study. Stroke 1991;22:983-8.

3) Rodgers M, McKenna C, Palmer S, Chambers D, Van Hout S, Golder S, et al. Curative catheter ablation in atrial fibrillation and typical atrial flutter: systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess 2008;12:iii-iv, xi-xiii, 1-198.

4) Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239-57.

5) Brink AJ, Torrington M. Progressive familial heart blocktwo types. S Afr Med J 19779;52:53-9.

6) Brugada J, Brugada R, Brugada P. Right bundle-branch block and ST-segment elevation in leads V1 through V3: a marker for sudden death in patients without demonstrable structural heart disease. Circulation 1998;97:457-60.

7) James TN. Apoptosis in cardiac disease. Am J Med 1999; 107:606-20.

8) James TN, St Martin E, Willis PW 3rd, Lohr TO. Apoptosis as a possible cause of gradual development of complete heart block and fatal arrhythmias associated with absence of the AV node, sinus node, and internodal pathways. Circulation 1996;93:1424-38.

9) James TN, Terasaki F, Pavlovich ER, Vikhert AM. Apoptosis and pleomorphic micromitochondriosis in the sinus nodes surgically excised from five patients with the long QT syndrome. J Lab Clin Med 1993;122:309-23.

10) Akcali KC, Sahiner M, Sahiner T. The role of bcl-2 family of genes during kindling. Epilepsia 2005;46:217-23.

11) Wijffels MC, Kirchhof CJ, Dorland R, Allessie MA. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation. A study in awake chronically instrumented goats. Circulation 1995;92:1954-68.

12) Schotten U, Duytschaever M, Ausma J, Eijsbouts S, Neuberger HR, Allessie M. Electrical and contractile remodeling during the first days of atrial fibrillation go hand in hand. Circulation 2003;107:1433-9.

13) Allessie MA, Boyden PA, Camm AJ, Kléber AG, Lab MJ, Legato MJ, et al. Pathophysiology and prevention of atrial fibrillation. Circulation 2001;103:769-77.

14) Thijssen VL, Ausma J, Borgers M. Structural remodelling during chronic atrial fibrillation: act of programmed cell survival. Cardiovasc Res 2001;52:14-24.

15) Sezai A, Hata M, Niino T, Kasamaki Y, Nakai T, Hirayama A, et al. Study of the factors related to atrial fibrillation after coronary artery bypass grafting: a search for a marker to predict the occurrence of atrial fibrillation before surgical intervention. J Thorac Cardiovasc Surg 2009;137:895-900.

16) Opferman JT, Letai A, Beard C, Sorcinelli MD, Ong CC, Korsmeyer SJ. Development and maintenance of B and T lymphocytes requires antiapoptotic MCL-1. Nature 2003; 426:671-6.

17) Akar AR AC, Durdu S, Aydin IT, Civril F, Tasoz R et al. Aortic vascular smooth muscle cell apoptosis in patients with type-A aortic dissection. Turkish J Vascular Surg 2005;14:25-30.

18) Ak K, Akgun S, Tecimer T, Isbir CS, Civelek A, Tekeli A, et al. Determination of histopathologic risk factors for postoperative atrial fibrillation in cardiac surgery. Ann Thorac Surg 2005;79:1970-5.

19) Guerra PG, Thibault B, Dubuc M, Talajic M, Roy D, Crépeau J, et al. Identification of atrial tissue in pulmonary veins using intravascular ultrasound. J Am Soc Echocardiogr 2003;16:982-7.

20) Haunstetter A, Izumo S. Future perspectives and potential implications of cardiac myocyte apoptosis. Cardiovasc Res 2000;45:795-801.

21) Akyürek O, Akyürek N, Sayin T, Dinçer I, Berkalp B, Akyol G, et al. Association between the severity of heart failure and the susceptibility of myocytes to apoptosis in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Int J Cardiol 2001;80:29-36.

22) Sabbah HN. Apoptotic cell death in heart failure. Cardiovasc Res 2000;45:704-12.

Keywords : Atriyal fibrilasyon; apoptozis; DNA fragmantasyonu
Viewed : 13784
Downloaded : 2510