Abstract

Endothelial seeding is assumed to be an effective method to improve patency rates of denuded vascular surfaces that is seen after angioplasty. In this study, following anesthesia jugulary veins of eight dogs where harvested bilaterally. From these veins endothelial cells were obtained enzymatically by collagenase and were passaged in to culture mediums until they reach a satisfactory number. After three weeks, dogs were anesthesied similar fashion. Their femoral veins were exposed and experimental intimal denudation were performed bilaterally. Subsequently, one of femoral artery was injected with cell solution and the other with saline solution. Two weeks after injections, arteriographic studies of femoral arteries were performed and arterial specimens were taken for histological evaluation. We concluded that patency rates were statistically significant between study and control sites (p<0.05). Histologic evaluations has also revealed that cultured endothelial cells have attached to the damaged surfaces. There were no cells on the control site. Thrombüs formation was also seen on the damaged subintimal layer despite there was nothing on the study site.

İlk kez 1829'da Lobstein' in ateroskleroz deyimini ortaya atması ile birlikte, bu patolojiye yönelik medikal ve cerrahi yaklaşımlarla, tedavi edici girişimlerde bulunulmuştur. Bu girişimlerden endarterektomi ve perkütan transluminal anjioplasti (PTA), bu gün en yaygın olarak kullanılan invaziv yöntemler arasında yer almaktadır [1-7].

Uzun yıllardan beri kullanılan her iki yöntemde de en büyük sorun, işlemin yapıldığı arter segmentinde restenoz ve tromboz gelişimidir. Bu nedenle de, yapılan girişimlerin başarı oranları düşük kalmaktadır [3-6]. Bu sorunları aşmak için platelet inhibitörleri, kalsiyum kanal blokerleri, düşük molekül ağırlıklı heparin (DMAH) medikal yöntemler ile stent ve aterektomi gibi mekanik yöntemler denenmiştir [3-6,8].

Ancak daha sonra yapılan değerlendirmeler, bunların hiç birisinde önemli ölçüde bir restenoz azalması elde edilemediğini göstermiştir. Olayın patofizyolojisi incelendiğinde ise, restenoza yol açan esas nedenin işlem sırasında endotel örtüsünün o segmentte harap edilmesi ve subendotelyal matriks dokusunun kanla teması olduğu görülmüştür. Endotel hücresinin, prostasiklin ve endotelyum derived relaksing (EDRF) faktör gibi platelet agregasyon inhibitörleri ile vazokonstrüktör (anjiotensin II, v.b) ve vazodilatör maddeler salgıladığı; böylece de bir yandan damar tonüsünün düzenlenmesine katkıda bulunurken, diğer yandan da lokal antitrombojenik etki gösterdiği belirlenmiştir [1,2,7,9,10-13]. Bu da çalışmacıları, endarterektomi ve PTA gibi işlemlerin yapıldığı bölgelerin yine aynı canlıdan elde edilerek üretilen endotel hücreleriyle örtülmesi; böylece girişim yapılan arter bölgesine hızla doğal yapısının tekrar kazandırılması fikrine yöneltmiştir [11-15].

Biz bu çalışmamızda, deneysel olarak intima harabiyeti oluşturduğumuz köpek arterlerine, hücre kültürlerinde daha önceden üretilmiş otojen endotel hücreleri vererek onların bu bölgelere tutunmalarını ve girişim sonrası arterin açık kalma oranını artırmayı amaçladık.

Methods

Çalışmada, her iki cinsten sağlıklı, 15-26 kilogram (kg.) ağırlığındaki sekiz adet sokak köpeği kullanıldı. Deneyler yapılırken Canadian Council on Animal Care' in prensiplerine uyuldu. Birinci aşamada, her köpeğin eksternal juguler veni, bilateral olarak çıkarıldı. Bu işlem için, köpeklere 3 miligram (mg.)/kg. xylazine ve 0.25 mg. intramüsküler (İ.M.) enjeksiyonundan yarım saat sonra, 25 mg./kg. ketamin HCl' ün yine İ.M. injeksiyonu ile genel anestezi uygulandı. İşlem sırasında hipovolemi ve hemokonsantrasyonu önlemek amacıyla, intravenöz (İ.V.) serum fizyolojik infüzyonu yapıldı. Tüm köpeklere deneyin her aşamasında, preoperatif koruyucu antibiyotik (Pronapen flakon 800; Pfizer, İstanbul-Türkiye) yapıldı.

Deneklerin boynunun her iki tarafından da eksternal juguler venler çıkarıldı. Daha sonra, içlerinden geçirilen bir prob yardımı ile, venlerin içi dışına çevrildi. Böylece, intimaları dışarıya çıkarılmış olan damarların, adventisyaları görülmeyecek şekilde içeriye gömülerek, her iki uçları da bağlandı.

Primer venöz endotel hücresi kültürü yapılırken Sank ve arkadaşlarının [20] kullandıkları metod esas alındı. Venler, 5 ml. fosfat tamponlu solüsyon (PBS-Dulbecco; Biochrom-Seromed, Berlin-Almanya) içende hazırlanan %0.5' lik kollagenaz (Collagenase; Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo-U.S.A.) solüsyonu ile yıkandı. Sonra venler, PBS-Dulbecco' da %0.5 oranında hazırlanan 20 ml.'lik kollagenaz solüsyonu içerisinde 37 °C' de 15 dk. bekletildi. İnkubasyon sonrasında solüsyon, 1000 devir/dakika (rpm.) da 5 dk. santrifüj edildi.

Hücreler, %20 FBS ihtiva eden, Dulbecco's minimal essantial medium nutrient mixtur (DMEM; Biocrom-Seromed Berlin-Almanya) vasatı içeren kültür flaskları içinde 37 °C’ deki etüve alınarak inkübasyona bırakıldı. Her üç günde bir vasat değiştirildi. Üçüncü haftadan itibaren, kültür flaskının birkaç noktasından morfolojik olarak endotel hücreleri, altıncı haftada flaskın tümünü kaplayarak, monolayer bir görünüm oluşturdular.

Monolayer endotel hücresi oluştuktan sonra, hücreler PBS içinde hazırlanmış %0.1 tripsin (Trypsin; Difco Laboratories, Detroid, Mi. U.S.A) ve %0.1 etilen diamine tetraasetik asit (EDTA; Difco Laboratories, Detroid, Mi.-U.S.A) ile flask yüzeyinden ayrılıp hücre süspansiyonu halinde 2 ml. olarak deneyin ikinci aşaması için hazırlandı.

Deneyin ikinci aşamasında da, köpeklere aynı şekilde anestezi ve medikasyon yapıldı. Her iki uyluğa yapılan vertikal kesilerle, femoral arterler bilateral olarak eksplore edildi. Denekler 100 ünite (ü.)/kg. dozundaki heparin ile heparinize edildikten sonra, önce sağ femoral arterine vasküler klemp konularak, klempin distaline arteriotomi yapıldı. Buradan sokulan 3.0x2.0 PTA kateteri (Cordis-Europass, Johnson&Johnson, Roden-Netherlands), distale doğru yönlendirilerek, sabit basınç uygulayabilen enjektör ile (Inflation device; B.Braun, Bethlehem, Pa-U.S.A) 9 atmosfer (atm.) basıncında 30 sn. boyunca şişirildi. Şişik durumdaki balon, ileriye ve geriye doğru hareket ettirilerek, 4 cm.’ lik bir segmentte deneysel intima harabiyeti oluşturuldu. Daha sonra bu bölgenin distaline de bir vasküler klemp konularak, 4 cm. boyunda izole bir arter segmenti hazırlandı.

Segment 10 ml. serum fizyolojik solüsyonu ile irrige edildi. Laboratuar çalışmacıları tarafından hazırlanan 2 ml.'lik solüsyonlardan bir tanesi serum fizyolojik, bir tanesi de endotel hücresi süspansiyonu içermekteydi. Hangisi olduğunu bilmediğimiz süspansiyonlardan bir tanesi alınarak, hazırlanan arter segmentine verildi.

Daha sonra, üçüncü bir vasküler klemp arteriotomi bölgesinin hemen distaline, harabiyet yapılan bölgenin proksimalinde olacak şekilde yerleştirildi. Böylece solüsyonun, intima harabiyeti yapılan arter segmentinde lokalizasyonu sağlandı. Arter segmenti, 15 dk. sonra vasküler klempler aracılığı ile 180° çevrilerek, yine 15 dk. daha beklenildi. Böylece, süspansiyon içinde olabileceği düşünülen endotel hücrelerinin, intima harabiyeti oluşturulan arter yüzeyi ile 30 dk. boyunca homojen olarak teması amaçlandı. Bu süre sonrasında, lümene verilen solüsyondan 1 ml. kadar örnek geriye alınarak laboratuar çalışmacılarına verildi. Daha sonra arteriotomi kesisi kapatılarak vasküler klempler kaldırıldı. Aynı işlemler, daha sonra sol femoral artere de tekrarlandı. Sonuçta aynı denek üzerinde, çalışma ve kontrol sahaları oluşturulmuş oldu. Bu işlem yapıldıktan sonra, antibiyotik proflaksisi dışında herhangi bir medikasyon yapılmadı. Deneklerin postoperatif 2. haftada yine aynı şekilde uygulanan genel anestezi altında, abdominal aortalarına yerleştirilen 5 french (F.) intraducer (Intraducer set 5F; Cordis, Johnson&Johnson, Roden-Netherlands) ile bilateral eşzamanlı femoral arteriografileri çekildi.

Aynı seansta deneklerin sağ ve sol femoral arterinden alınan spesmenler, Hematoksilen eosin (HE) ile boyandı. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobu (Olympus BH2, Tokyo-Japonya) ile incelendi. Burada her deneğin çalışma ve kontrol bölgelerinden alınan örneklerdeki endotel hücre bütünlüğü ve yine çalışma gruplarındaki hücrelerin harap edilmiş arter yüzeyine tutunmaları, histolojik olarak değerlendirildi.

Deneklerin postoperatif ikinci haftada çekilen eşzamanlı sağ ve sol femoral arteriografilerinin değerlendirilmesi sonucunda, çalışma ve kontrol taraflarındaki stenoz oranları % olarak bulundu. Her iki taraftan da elde edilen bu oranlar, Mann-Whitney U testi ile karşılaştırıldı.

Histolojik değerlendirme sırasında, intima harabiyeti oluşturulmuş olan subendotelyal tabaka üzerine hücre kültüründe üretilen endotel hücrelerinin tutunmuş olarak görülmesi durumunda seeding başarılı, subendotelyal tabaka üzerinde tutunmuş olan herhangi bir endotel hücresinin görülmemesi ve trombüs bulunması durumunda ise başarısız olarak değerlendirildi.

Results

Deneklerden elde edilen arteriografi sonuçları şöyleydi:

Postoperatif ikinci haftada, deneklerin çalışma ve kontrol taraflarından alınan dokulardan hazırlanan preparatlar 132x büyütmede değerlendirildi. Buna göre:

Tüm deneklerin çalışma tarafında harap edilmiş intimadan geriye kalan subendotelyal tabaka üzerine kültürde üretilmiş olan endotel hücrelerinin tutundukları ve monolayer bir görünüm oluşturdukları izlendi. Arter lümeninde herhangi bir trombüs gelişimi yoktu. Kontrol tarafında ise yapılan harabiyet nedeniyle intima dokusunun kaybolduğu, internal elastik laminada yer yer yırtılmalar olduğu ve lümende trombüs geliştiği gözlendi.

Discussion

Endotel hücrelerinin lokal antitrombotik fonksiyonları olduğu, birçok çalışmada açıkça gösterilmiştir. Bu hücreler, doku plazminojen aktivatörleri gibi fibrinolitik ajanlar ile, EDRF ve prostasiklin gibi aynı zamanda vazodilatatör özelliği de olan, antiplatelet ajanlar salgılarlar.

Bu hücrelerden ayrıca, miyointimal hiperplazide görülen düz kas proliferasyonu ve migrasyonunu da inhibe edebilen, heparin benzeri moleküllerin de salgılandığı gösterilmiştir [1,2,7,12,13].

Femoropopliteal PTA uygulanan hastalarda restenoz gelişimi, her zaman önemli bir problem olagelmiştir. Bu hastalarda restenoz, miyointimal hiperplazi ile ateroskleroz gelişmesi sonucu ortaya çıkmaktadır [3,5,8]. Bu nedenle de, bu türden girişimlerden beklenilen ölçüde başarılı sonuçlar alınamamıştır. Gray ve arkadaşları [21], 55 hastada yaptıkları femoral anjioplastilerde, birinci yılda açık kalma oranını %22 olarak bulmuşlardır. Biz de yaptığımız çalışmada, kontrol tarafında 2. hafta sonrasında açık kalma oranını %65 olarak bulduk [3,5,8].

PTA ve endarterektomiden sonraki açık kalma oranlarının endothelial seeding ile artırıldığı, birçok çalışmada gösterilmiştir. Bununla ilgili deneysel çalışmalar, arterial injüriden sonraki miyointimal hiperplazi ve trombüs oluşumunun, işlemden sonra rejenere olan damarın kendi endotelyumu ile azaltıldığını göstermektedir. Bu nedenle, PTA alanlarının otolog endotel hücreleri ile kaplanmasının miyointimal hiperplaziyi ve trombüs oluşumunu azaltacağı, teorik olarak da düşünülebilir [15-19].

Literatürde de belirtildiği gibi biz de, endothelial seedingi suni greftler yerine subendotelyal doku üzerine yapmaya karar verdik [14,16-19]. Thompson ve arkadaşları [14], deneysel endotel harabiyeti oluşturduktan sonra, %4 paraformaldehit -%2 glutaraldehit ile muamele ettikleri insan safen veni segmentlerine, endothelial seeding uygulamışlardır. Bu çalışmacılar, intima harabiyeti oluştururken PTA balonunu 9 atm. basıncında ve 30 sn. boyunca şişirerek oluşturulan deneysel intima harabiyetini standardize etmişlerdir. Biz de buradan yola çıkarak, aynı yöntemi uyguladık ve böylece her deneğin kontrol ve çalışma taraflarında oluşturduğumuz intima harabiyetini standardize etmiş olduk.

Sterpetti ve arkadaşları [18], karotis endarterektomisi yaptıkları köpeklere endothelial seeding uygulamışlar ve endarterektomize yüzeylere seeding yapılması sonrasında bu bölgelere platelet tutulumunun azaldığını göstermişlerdir. Bu çalışmacılar, seeding sırasında kültürde ürettikleri endotel hücrelerini endarterektomize karotis arterinde 20 dk. tuttuktan sonra, arter akımını serbest bırakmışlardır. Thompson ve arkadaşları [14] ise yaptıkları çalışmada, ven greftlerinde yeterli bir seeding için optimum süreyi ve araştırmışlar ve sürenin 30 dk. kadar olmasının yeterli olduğunu; daha uzun sürelerin seedingde herhangi bir artış yapmadığını bildirmişlerdir.

Arteriografi sonuçlarını istatistiksel olarak değerlendirdiğimizde, kontrol ve çalışma gruplarını oluşturan arterlerde belirlenen lümen kayıpları arasındaki farkın, istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gördük (p<0.05). Çalışmamızda iki hafta sonra çekilen arteriografilerdeki açık kalma oranları kontrol tarafında %65 olarak bulunurken, çalışma tarafında bu değer %85 olarak değerlendirildi. Bush ve arkadaşları [22], köpeklerde oluşturdukları deneysel karotis endarterektomilerinde, yüksek dansiteli otojen endotel hücreleri ile seeding yapmışlar ve altıncı haftada çektikleri anjiografilerde açık kalma oranlarını seeding yapılan tarafta %88, yapılmayan tarafta ise %35 olarak bulmuşlardır. Bizim çalışmamızda seeding yapılan tarafta elde ettiğimiz sonuçlar, bu literatür ile benzerlik göstermektedir. Kontrol tarafında elde ettiğimiz değerler, çalışmacıların kontrol değerleri ile karşılaştırıldığı zaman daha yüksek gibi görünse de, denekleri daha uzun süreler izleme imkanlarımızın kısıtlı olması nedeniyle çalışmamızdaki anjiografilerin ikinci haftada çekildiği de düşünülürse, erken dönemde alınan bu sonuçların literatür ile tutarlı olduğu kanaatine varılabilir.

Çalışmacılar, seeding sonrası aldıkları örneklerin mikroskobik değerlendirmelerinin sonucunda da seeding çalışmalarının başarılı olduğunu bildirmişlerdir [14,15]. Sterpetti ve arkadaşları [18], çalışmalarından 4 hafta sonra yaptıkları histopatolojik değerlendirmede, seeding yapılan tarafta platelet birikiminin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığını belirtmişlerdir. Biz de çalışmamızdan iki hafta sonra değerlendirdiğimiz histolojik kesitlerde literatür ile uyumlu bulgular elde ettik. İnternal elastik lamina üzerindeki subendotelyum tabakasına yerleşmiş olan endotel hücreleri çalışma tarafında gözlenirken, kontrol tarafında görülmemekle beraber lümende trombüs izlenmesi, seeding çalışmamızın erken dönemde başarılı olduğunu histolojik olarak da göstermektedir.

Bu çalışma, T.C. Fırat Üniversitesi, Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Club Hotel Sirene, Belek-Antalya'da 20-24 Ekim 1998 tarihinde yapılan 5. Ulusal Göğüs, Kalp ve Damar Cerrahisi Kongresi'nde sözlü bildiri olarak sunulmuştur.

References

1) Haimovici H, De Palma R.G. Atherosclerosis: Biologic and surgical considerations. Haimovici H; Vascular Surgery. Principles and Tecniques, Cambridge-Massachusetts, U.S. A, Blackwell Science Inc. 1996.

2) Zarins C, Glagov S. Artery wall pathology in atherosclerosis. Rutherford R.B; Vascular Surgery, Philadelphia, LJ.S.A, W.B. Saunders Co. 1995.

3) Kumpe D.A, Becker G.J. Percutaneus transluminal angioplasty and other endovascular technologies. Rutherford R.B; Vascular Surgery, Philadelphia, U.S.A. W.B. Saunders Co. 1995.

4) Stoney R.J, Thompson R.W. Endarterectomy. Rutherford R.B; Vascular Surgery, Philadelphia, U.S.A. W.B. Saunders Co. 1995.

5) Fogarty T.J, Zarins C, Piantanida P, Newman C, Hermann G. Intraoperative transluminal angioplasty. Haimovici H; Vascular Surgery. Principles and Tecniques, Cambridge-Massachusetts, U.S.A. Blackwell Science Inc. 1996.

6) Haimovici H. Endarterectomy. In: Haimovici H; Vascular Surgery. Principles and Tecniques, Cambridge-Massachusetts, U.S.A. Blackwell Science Inc. 1996.

7) Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis. Braunwald E; Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, W.B. Saunders Co. 1992.

8) Baim D.S. Interventional catheterization techniques: Percutaneus transluminal balloon angioplasty, valvuloplasty, and related procedures. Braunwald E; Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, W.B. Saunders Co. 1992.

9) Chervu A, Clagett P. Bleeding & clotting disorders. Dean R.H, Yao J.S.T, Brewster D.C; Current Diagnosis and Treatment in Vascular Surgery, Appleton & Lange. 1995.

10) Theroux P, Lidon R-M. Anticoagulants and their use in acute ischemic syndrornes. Topol EJ; Textbook of Interventional Cardiology, W.B. Saunders Co. 1994.

11) Esmon CT, The regulation of natural anticoagulant pathways. Science 1987; 235: 1348-1352.

12) Şahin M, Alp N. Endothelin'in klinik kardiyolojide yeri ve önemi. MN Kard 1995; 2: 73-76.

13) Gök H, Tokaç M, Korkmaz G, Korkut B, Telli H. Endotel disfonksiyonu. MN Kard 1995; 2: 1-7.

14) Thompson MM, Budd JS, Eady S. Ailen KE, James M, James RF. Effect of seeding time and density on endothelial celi attachment to damaged vascular surfaces. Br J Surg 1993; 80: 359-362.

15) Nabel EG, Plautz G, Beyce FM, Stanley JC, Nabel GJ. Rekombinant gene expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall. Science 1989; 244:1342-1344.

16) Thompson MM, Budd JS, Eady SL, Hartley G, Early M, James RF. Platelet deposition after angioplasty is abolished by restoration of the endothelial cell monolayer. J Vasc Surg 1994; 19: 478-86.

17) Thompson MM, Budd JS, Eady SL, Underwood MJ, James RF, Bell PR. The effect of transluminal endothelial seeding on myointimal hyperplasia following angioplasty. Eur J Vasc Surg 1994; 8: 423-434.

18) Sterpetti AV, Schultz RD, Bailey RT. Endothelial cell seeding after carotid endarterectomy in a canine model reduces platelet uptake. Eur J Vasc Surg 1992; 6: 390-394.

19) Smyth J.V, Rooney O.B, Dodd P.D, Walker MG: Culture of human adult endothelial cells on endarterectomy surfaces. Eur J Vasc Endovasc Surg 1995; 10: 308-15.

20) Sank A, Rostami K, Weaver F, Ertl D, Yellin A, Nimni M et. al. New evidence and new hope concerning endothelial seeding of vascular grafts. Am J Surg 1992; 164: 199-204.

21) Gray BH, Sullivan TM, Childs MB, Young JR, Olin JW: High incidence of restenosis/reocclusion of stents in percutaneus treatrnent of long-segment superficial femoral artery disease after suboptimal angioplasty. J Vasc Surg 1997; 25:74-83.

22) Bush HL Jr, Jakubowski J A, Sentissi JM, Curl GR, Hayes JA, Deykin D. Neointimal hyperplasia occuring after carotid endarterectomy in a canine model: effect of endothelial cell seeding versus perioperative aspirin. J Vasc Surg 1987; 5: 118-125.